组织工程化人工神经修复周围神经缺损的实验研究

目的　研究雪旺细胞和生物降解支架材料复合后构建成的组织工程化人工神经修复神经缺损的效果。方法　将雪旺细胞制成 1× 1 0 8/ml的ECM (extracellularmatrix,ECM)凝胶 ,与PLA无纺纤维布复合培养 7d ,置入PLA中空纤维管中 ,构建成组织工程化人工神经。建立大鼠坐骨神经缺损 1 0mm的动物模型 ,A组为人工神经组 ;B组为雪旺细胞复合ECM凝胶组 ;C组为单纯ECM凝胶组 ;D组为自体神经移植组。术后 8周、1 2周 ,行神经电生理和组织学检测评价疗效。结果　术后 1 2周A组的再生神经纤维已越过远端缝合口 ,有髓神经纤维数和神经纤维密度稍差于D组 ,但再生神经组织的面积显著高于后者 ;A、D组的髓鞘厚度和dLAT、NCV、AMP、AREA均无显著差别 ,但明显高于B、C组。结论　雪旺细胞、ECM凝胶和PLA多孔材料与PLA中空纤维管组合后构建成的组织工程化人工神经 ,修复周围神经缺损的效果接近于自体神经移植     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

用去细胞同种异体神经构建猕猴组织工程化神经的实验研究

目的评价用自体源骨髓间充质干细胞(MSCs)或许旺细胞(SCs)作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴尺神经4cm缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法分别用4种移植物桥接猕猴4cm尺神经缺损。A组:种植自体MSCs的去细胞同种异体神经;B组:种植自体SCs的去细胞同种异体神经;C组:去细胞同种异体神经;D组:自体神经移植。通过功能学、神经电生理学及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果A、B组术后6个月能引起小鱼际肌群产生复合动作电位的潜伏期、复合动作电位的最大振幅、神经传导速度和再生的神经纤维数目与自体神经移植组相比无统计学意义(P>0.05);但A、B、C、D组分别与C组相比,差异有统计学意义(P>0.05)。结论用自体源SCs或MSCs作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴4cm尺神经缺损,均能取得与自体神经移植相近的效果。     

组织工程化人工骨修复骨缺损的实验研究

[目的]观察兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃联合培养构建的组织工程化人工骨修复兔桡骨缺损的效果,探讨组织工程化人工骨促进骨缺损修复的作用机制.[方法]体外分离培养兔的骨髓基质细胞,经过传代扩增后,与生物活性玻璃联合立体培养构建组织工程化人工骨后,植入兔桡骨缺损处.通过大体形态观察、影像学、组织学、扫描电镜检查及生物力学分析,分别与单纯植入生物活性玻璃、髂骨以及空白组进行对比,观察各组对骨缺损修复的效果.[结果]植入组织工程化人工骨的兔桡骨缺损完全愈合,成骨效果与自体髂骨相似明显优于其他组.[结论]骨髓基质细胞复合生物活性玻璃构建的组织工程化人工骨能很好的完成骨缺损的修复.     

应用骨髓基质干细胞体外构建组织工程化管状软骨的实验研究

目的以骨髓基质干细胞(bone m arrow strom a cells,BMSCs)为种子细胞,接种于管状聚羟基乙酸(PGA)支架上,在体外构建组织工程化管状软骨。方法取长枫杂交仔猪髂骨骨髓,在低糖DMEM完全培养液培养2周,传代后以浓度为5×107/m l细胞悬液均匀接种于管状PGA支架上,以高糖DMEM低血清特定培养液诱导(含胰岛素2 mg/L、转铁蛋白3 mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10-7mol/L、TGF-β10ng/L、葡萄糖4.5 mg/m l、2%胎牛血清),连续诱导培养10周,从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对再生组织进行评价。结果6周时染色见BMSCs-PGA复合物表层为2~4层成纤维样细胞组成的软骨膜,下层为较成熟的软骨组织,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,有很多散在PGA纤维,而在中间部分,组织量较少,结构较构散。10周时BMSCs-PGA复合物外观呈乳白色软骨样,管壁较厚,有一定的弹性,但中间部管腔塌陷较明显,苏木素-伊红染色见实验组管状BMSCs-PGA和6周时相似,但结构更致密和规则,细胞数量较正常软骨组织少,还可见少量的未降解的PGA纤维。免疫组化证实形成的组织有Ⅱ型胶原分布。结论管状BMSCs-PGA复合物在特定培养液诱导下,在体外能形成管状软骨,这为将来临床应用BMSCs作为种子细胞,修复软骨缺损或构建复合组织气管提供了实验基础和技术参数。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

磷酸钙人工骨结合骨髓基质干细胞移植修复骨缺损的实验研究

目的制备磷酸钙人工骨(calcium phosphats artifieal bone, CPC)与骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)复合物，通过动物实验研究其对骨缺损的修复作用。方法分离、扩增兔的BMSCs，并以CPC为载体制备cPc／BMSCs复合物，植入兔桡骨15mm骨缺损处。于术后不同时间处死动物，通过X线摄片、组织学染色分析和放射性核素监测，观察新骨形成和材料降解情况。同时以单纯的CPC及空白对照组作为对照研究，评价CPC／BMSCs复合物对骨缺损的修复能力。结果CPC／BMSCs复合物可再生新骨组织并完好地修复桡骨缺损，且其修复能力明显优于单纯的CPC。结论以CPC为载体的自体骨髓细胞移植能有效的修复骨缺损。     

诱导成鼠骨髓源神经干细胞的实验研究

目的：探讨体外诱导成鼠骨髓源神经干细胞的可行性。方法：以含20ng／ml碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)与表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的无血清培养液培养成鼠骨髓细胞，待细胞球形成后进行传代培养与单细胞克隆试验．以含100ng／ml bFGF培养液诱导分化，细胞免疫组化染色进行细胞鉴定。结果：骨髓细胞在诱导条件下形成表达Nestin抗原的细胞球．亦表达造血干细胞标志性抗原CD90。分离成单细胞后很快形成新的细胞球，并可分化出神经元与胶质细胞。结论：骨髓细胞可在体外诱导为能自我增殖的神经干细胞。     

骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcellsBMSCs) ,又称骨髓间充质干细胞 ,是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞。自 1968年Friendenstein利用BMSCs的粘附性特点 ,对其进行分离、培养 ,及多分化潜能研究以来〔1〕,BMSCs成为现代生物学和医学领域研究的热点。现普遍认为BMSCs是中胚层发育的早期细胞 ,具有多向分化潜能 ,不仅能分化为造血实质 ,支持造血 ,还可分化为多种造血以外的组织细胞 ,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、肝…     

组织工程化人工神经实验研究

目的 研究组织工程化人工神经修复大鼠2.5cm长坐骨神经缺损的效果。方法 21只2月龄Lewis lw雌性大鼠随机分成三个神经移植组,每组7只。A组:种植同源雪旺细胞并具有内部支架结构的胶原神经管,即组织工程化人工神经。B组:无雪旺细胞但具有内部支架结构的胶原神经管。C组:自体神经移植组。术后六个月,进行系列神经电生理监测,神经肌肉组织学观察,S-100和神经微丝蛋白(Neurofilament)免疫组化染色,轴突计数等检查。结果 在A组和C组移植神经上均能诱发出波幅明显的神经肌肉复合动作电位(CMAP),再生轴突已通过移植神经全长,远端肌肉轻度萎缩。而B组中没有或仅记录到极小波幅的CMAP,移植神经远端结缔纤维组织增生,再生轴突罕见,所支配肌肉明显萎缩。结论 初步结果显示:组织工程化人工神经可用来修复大鼠长段神经缺损。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨组织的实验研究

目的 探讨利用软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质细胞(BMSC)在体外构建软骨组织的可行性.方法 将分离出的猪骨髓基质细胞和软骨细胞进行体外培养,收集软骨细胞培养上清液,作为骨髓基质细胞诱导液从第2代开始进行诱导分化.7 d后取出标本,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达.体外分离培养的骨髓基质细胞与软骨细胞,扩增后两者以8∶2比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC以及20%上述浓度(1.0×107/ml)的单纯软骨细胞作为对照组.标本于8周后取材,行大体观察、湿重、蛋白多糖(GAGs)含量测定、组织学及免疫组化等相关检测.结果 经诱导后的骨髓基质细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.混合细胞组及阳性对照组体外培养8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,两组新生软骨在外观及组织学特征上也基本相同,免疫组化结果 表明两组均大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,共培养组的平均湿重和蛋白多糖(GAGs)含量均达到阳性对照组的70%以上.而单纯骨髓基质细胞组仅在局部形成了极少量幼稚的软骨样组织,且材料支架明显皱缩变形.低软骨细胞浓度组虽新生软骨湿重量能达阳性对照组的30%,但材料支架明显皱缩变形,仅在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论 软骨细胞能在一定程度上提供软骨形成的微环境,有效地诱导BMSC向软骨细胞分化,并在体外形成组织工程化的软骨组织.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of chondrogenesis in vitro with bone marrow stromal cells (BMSCs) induced by the co-cultured chondrocytes. Methods The BMSCs and chondrocytes were separated from pig and cultured. The supernatant of chondrocytes was used as the inducing solution for BMSCs from the 2nd generation. 7 days later, samples were taken and underwent immunohistochemistry and RT-PCR for detection of the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen,type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA. The cultured BMSCs and chondrocytes were mixed at a ratio of 8:2(BMSC: cartilage cell) and were inoculated into a polyglycolic acid/polylactic acid (PGA/PLA) scaffold at the final concentration of 5.0 × 107/ml. The cartilage cells and BMSCs were also inoculated seperately at the same concentration as the positive and negative control. Pure cartilage cells at 20% of the abovementioned concentration (1.0 × 107/ml) were used as the low concentration cartilage cell control group. Samples were collected 8 weeks later. General observations, wet weight, glycosaminoglycans (GAGs) determination and histological and immunohistochemistry examinations were performed. Results The expression of type Ⅱ collagen, type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA were positive in induced BMSCs.In the co-cultured group and the positive control group, pure mature cartilage was formed after 8 weeks of culture in vitro, and the size and shape of the scaffold were maintained. The newly formed cartilage in the two groups were almost the same in appearance and histological properties. The immunohistochemistry results indicated that the cartilage cells of the two groups all expressed ample cartilage-specific type Ⅱ collagen. The average wet weight and GAG content in the co-cultured group reached more than 70% of those in positive control group. Only an extremely small amount of immature cartilage tissues was formed in local regions in pure BMSC group, and the scaffold was obviously shrunk and deformed. Although the wet weight of newly generated cartilage tissue in the low concentration cartilage cell group reached 30% of that in positive control group, the scaffold was obviously shrunken and deformed. Only regional and discontinuous cartilage tissues were formed, and the amount of newly formed cartilage was obviously less than that in the co-culture group and the positive control group. Conclusions Chondrocytes can provide a micro-environment for the formation of cartilage, and also effectively induce BMSC to differentiate into chondrocytes and form tissue-engineered cartilage in vitro.     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

同种异体骨髓基质细胞肌肉内成骨分化的实验研究

目的 观察并探讨同种异体兔骨髓基质细胞在未接受免疫抑制剂的正常兔肌肉内移植后的免疫原性、存活及成骨状况.方法 首先通过兔谱系差异选择供、受体,并采用淋巴细胞反应进一步证实免疫学错配,之后抽取兔骨髓、体外分离培养、获取骨髓基质细胞,体外加矿化条件培养液诱导成骨、并对成骨特性予以鉴定后,将异体骨髓基质细胞移植入受体兔肌肉内,从淋巴细胞转化率、淋巴细胞杀伤活性、组织学检查、种子细胞体内成活及成骨情况等方面检测. 结果 术后各检测时间,异体骨髓基质细胞移植未诱发淋巴细胞大量增殖反应(P>0.05),淋巴细胞杀伤活性与自体组差异无统计学意义(P>0.05),移植区未见到大量炎性细胞浸润,经组织学及免疫组化染色证实异体骨髓基质细胞在受体组织内存活,8周后于异体肌肉中形成骨组织. 结论 同种异体骨髓基质细胞移植,未诱发免疫排斥反应,在无免疫抑制剂应用的情况下,移植细胞在受体肌肉内存活、并形成骨性组织.     

自体骨髓基质干细胞在齿槽裂骨缺损修复中的应用

目的探讨人自体骨髓基质干细胞（human bone marrow stromal cells，hBMSCs）在治疗齿槽裂骨缺损中的可行性。方法2002至2005年，选择齿槽裂骨缺损患者7例（单侧6例，双侧1例），以患者自体骨髓基质干细胞为种子细胞，部分脱钙骨（partly demineralized bone matrix，pDBM）为支架材料构建组织工程骨，治疗齿槽裂骨缺损。从患者髂前上棘穿刺取骨髓，密度梯度离心法分离hBMSCs，经体外成骨诱导和扩增至第3代。将诱导的hBMSCs，复合部分脱钙骨体外培养1周后，手术回植骨缺损区。分别于术后1、3、6、12、24、36个月进行临床外形和三维CT检查随访。结果6例患者头部三维CT检查，结果示术后3个月能形成组织工程化骨，并修复骨组织缺损。术后1～3年的随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收现象，临床治疗效果稳定。1例患者（双侧齿槽裂）植入物外露感染。结论以自体hBMSCs为种子细胞，部分脱钙骨为支架材料，利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织，并临床修复齿槽裂骨缺损。     

自体骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的初步研究

目的应用自体骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs。将第二代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损(n=6);以单纯珊瑚植入缺损处为对照(n=6),术后12、32周分别通过影像学,大体形态观察,组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果成骨诱导的BMSCs在珊瑚支架上生长良好。X线片显示12周时实验组骨痂较多,对照组材料明显吸收;32周时CT、X线片和大体观察显示术后实验组骨愈合良好,对照组为骨不连;骨密度检测示实验组显著高于对照组(P<0.05);组织学示实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合;生物力学测试实验组与正常下颌骨力学强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

种植脂肪干细胞的去细胞神经修复坐骨神经缺损的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)应用于组织工程化外周神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只体重200～220 g的雌性F344大鼠随机分成6组,每组8只,分别用下面6种不同的实验组修复15 mm长坐骨神经缺损.A组:种植ADSCs的去细胞神经;B组:种植诱导ADSCs的去细胞神经;C组:种植许旺细胞(SCs)的去细胞神经;D组:去细胞神经;E组:自体神经移植;F组:空白对照.通过神经电生理检测、荧光金逆行示踪、组织学检测和坐骨神经功能指数测定评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后12周,F组未见桥接物,A组和B组的神经电生理等各项指标均分别优于D组(P＜0.05或P＜0.01),与C组和E组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初步结果显示ADSCs及诱导后ADSCs作为种子细胞,与去细胞神经构建的组织工程化外周神经移植体,能够修复外周神经缺损.     

诱导骨髓基质细胞成血管平滑肌细胞的研究

目的 探讨体外诱导犬骨髓基质细胞(SMSC)为血管平滑肌细胞(VSMC)及其成血管的能力.方法 用含血小板源性生长因子(PDGF-BB)10ìg/L的内皮细胞培养液-2(EGM-2)诱导,无PDGF-BB的EGM-2培养液为对照,检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SM actin)与肌钙结合蛋白(calponin)的表达并接种于聚羟基乙酸(PGA)培养4周后取材.结果 诱导组(n=5)细胞逐步呈平滑肌样转变,表达a-SM actin与calponin,流式细胞仪阳性率分别为(45.16±0.97)%、(37.54 4±1.15)%,可成血管样结构,对照组(n=5)变化不明显,阳性率(7.92±1.04)%、(6.37±0.83)%,成血管样结构能力差.结论 体外可诱导犬BMSC为VSMC并有成血管样结构的能力.     

以骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的 探讨构建特定形态带内支撑组织工程化软骨的医用假体的可能性.方法 以直径3 mm、长5 mm的圆柱状多孔高密度聚乙烯(Medpor)外裹厚1 mm的聚羟基乙酸为支架,将体外培养的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs).按10×107/ml的细胞浓度均匀接种于支架,常规培养液培养5 d后,用含诱导因子的培养液立体诱导4周,同时以相同浓度的软骨细胞和BMSCs分别接种,常规体外培养4周作为阳性对照组和阴性对照组,分别种植于裸鼠皮下,4、8周后取材,行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化及糖氨聚糖(GAG)定量等检测.结果 各组细胞均与材料粘附良好.实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的Medper-软骨复合体,内部的Medper与外层软骨结合紧密.组织学可见成熟软骨陷窝并渗入Medper孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原表达,实验组GAG含量4、8周时分别为(5.13 ±0.32)mg/g、(5.37±0.12)mg/g.结论 以BMSCs作为种子细胞可于体内构建特定形态、组织学良好的Medpor-软骨复合体.