全蝎胃蛋白酶酶解混合多肽体外抗凝活性研究及其组成分析

目的采用凝胶过滤层析法分离全蝎酶解液的抗凝活性部位,并检测活性部分的分子量分布范围。方法采用紫外检测法、考马斯亮蓝法检测,合并凝胶层析蛋白流分;以APTT凝血时间为指标,检验各组分体外抗凝活性;通过MALDI-TOF-MASS法检测分离部分的分子量分布范围。结果全蝎酶解液通过凝胶过滤层析分得的2组分抗凝效果显著,分子量分布范围850~5 300。结论体外抗凝试验表明:凝胶过滤层析法纯化分离全蝎胃蛋白酶酶解液方法可行,MALDI-TOF-MASS表明活性组分为小分子肽类。     

小鼠黑色素瘤凝集的分离纯化

目的：制备并纯化小鼠黑色素凝集素（MMA）。方法：利用亲合层析及凝胶过滤层桥从小鼠B16黑色素瘤中分高纯化小鼠黑色素瘤凝集素（MMA）。结果：利用亲和层材制备的凝集素,经SDS-PAGE显示出一条分子量12．4kD的主要蛋白带和两个分子量为35kD和67kD的痕迹蛋白带;经凝胶过滤层析则出现分子量为26kD主峰及分子量为35kD和67kD的两个小峰。26kD的蛋白成分经SDS－PAGE和等电聚焦电泳显示出一条均一的蛋白带。26kD的蛋白成分特异性识别会多聚乙酰氢基乳精的糖链,活性依赖于巯基而非钙离子。结论：26kD的成分为MMA,利用经亲和层析和凝胶过滤层析等可得到成分均一的MMA,MMA为S型凝集素。     

人精浆中γ—精浆蛋白的分离纯化研究

通过离心，透析分离正常人精浆，再经二次Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤层析，成功的纯化了γ－精浆蛋白。等电聚焦电泳法测等电点的约为ｐＩ６．５，凝胶过滤层析法测其分子量约为２８０００。     

组织因子单克隆抗体及对照抗体的制备、纯化和鉴定

目的纯化组织因子(TF)单克隆抗体及对照抗体。方法给小鼠腹腔注射杂交瘤8A3和9E10细胞,产生的腹水应用凝胶过滤层析法和Protein A亲和层析法纯化组织因子抗体及对照抗体,并用SDS-PAGE和BCA法检测纯化后单克隆抗体的纯度及蛋白浓度。结果单抗纯化后电泳重链和轻链都呈一条带,TF抗体和对照抗体的最终浓度分别为0.7726mg/ml和0.8592mg/ml。结论应用层析法和凝胶过滤和Protein A亲和分离层析法纯化抗体,能够得到纯度较高的单克隆抗体。     

爬行动物的体液免疫

爬行动物针对颗粒性和可溶性抗原,能够快速、有效的产生抗体。爬行动物血清中的抗体主要包括高分子量的免疫球蛋白(HMWIg)和不止一种的低分子量免疫球蛋白(LMWIg),爬行动物中还有在亲代和子代间传递的免疫球蛋白Ig Y。目前爬行动物免疫球蛋白的纯化方法主要有:硫酸铵沉淀法、联合凝胶过滤层析和离子交换层析法、Protein A亲和层析法。研究爬行动物体液免疫对研究动物免疫的进化及对病原控制具有重要意义。     

Slit2-Robo1信号阻断抗体及对照抗体的制备、纯化和鉴定

目的纯化Slit2-Robo1信号阻断抗体(R5抗体)及对照抗体。方法给小鼠腹腔注射杂交瘤3B2.3和CRL-1608细胞,产生的腹水应用凝胶过滤层析法和Protein A亲和层析法纯化R5抗体及对照抗体,并用SDS-PAGE和BCA法检测纯化后单克隆抗体的纯度及浓度。结果单抗纯化后电泳重链和轻链都呈一条带,R5抗体及对照抗体的质量浓度分别为0.986 mg/mL和3.57 mg/mL。结论应用层析法和Protein A亲和层析法纯化抗体,能够得到纯度较高的单克隆抗体。     

人呼吸道合胞病毒不同纯化方法的比较研究

目的比较人呼吸道合胞病毒(HRSV)的2种纯化方法。方法 HRSV经超滤浓缩后,分别采用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化。对纯化产物进行感染性效价、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot检测,并取目的产物免疫ICR小鼠,检测免疫血清的中和抗体效价。结果经还原电泳,蔗糖密度梯度离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析的纯化产物都在60~70kDa间呈现一主要条带,前者证实为HRSV特异性F蛋白;但在Sepharose 4FF凝胶过滤层析3个样品(第2峰)中检测出目的病毒,感染性效价分别为4.50、4.25和6.25 lgCCID50/ml。两种方法所得纯化产物免疫ICR小鼠均能诱导产生中和抗体,几何平均效价(GMT)为1∶13.93~1∶4.00。含铝佐剂组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是不含铝佐剂组的1.5~2.0倍和1.0~1.4倍。β-丙内酯灭活组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是甲醛灭活组的1.0~1.3倍和1.0~1.1倍。结论蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法均能纯化出HRSV,后者效果更好、效率更高。加铝佐剂有助于提高抗体阳转率;β-丙内酯和甲醛2种灭活剂对免疫效果的影响差异不大。     

亲和层析法提取纯化人心肌肌钙蛋白I

目的 研究出一种提纯人心肌肌钙蛋白I (cTnI)的简便方法.方法 将兔骨骼肌肌钙蛋白C (sTnC)与经溴化氰活化的Sepharose 4B凝胶偶联,制成sTnC亲和层析柱.人心肌经匀浆、离心后, 上清液上sTnC亲和层析柱,洗脱后可获得cTnI纯品.结果 SDS-PAGE得到一条电泳带,其分子量为25 kD.Western blot结果表明,提纯的cTnI可被cTnI单克隆抗体特异性识别.cTnI产率为82.6 mg/100 g人心肌.结论 亲和层析法提高了cTnI的产率,为下一步cTnI体外诊断的研究工作打下基础.     

人精浆中γ－精浆蛋白的分离纯化研究

通过离心，透析分离正常人精浆，再经二次ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析，成功的纯化了γ－精浆蛋白。等电聚焦电冰法测其等电点约为ｐＩ６．５，凝胶过滤层析法测其分子量约为２８０００。免疫电泳结果证明其纯度较高，并与人血清、唾液、初乳等无交叉抗原。在法医物征实践及临床诊断方面均具有重要意义。     

圆斑蝰蛇泰国亚种(Vipera russelli siamensis)蛇毒凝血Ⅹ因子激活剂的纯化及部分特性研究

目的从圆斑蝰蛇泰国亚种蛇毒中分离纯化凝血Ⅹ因子(FⅩ)激活剂并研究其部分特性. 方法采用离子交换柱层析和凝胶过滤等方法进行分离纯化,以血液凝固时间及发色底物(S-2222)进行活性鉴定和温度、pH值、蛋白酶抑制剂对活性的影响,SDS-PAGE进行分子量、等电点及纯度测定,苯酚-硫酸法及间苯二酚-盐酸法测定糖含量. 结果所得促凝组分Ⅳ1能特异性地活化牛FⅩ,从而水解S-2222酰胺键.SDS-PAGE呈现单一蛋白带,分子量为61.1±1.5 kD(还原),60.4±1.9 kD(非还原).等电点为pH＝8.00±0.06.含中性己糖12.4%±0.5%,唾液酸0.12%±0.02%.在50 ℃以下稳定,最适pH为7.0～8.2.可被金属蛋白酶抑制剂EDTA-Na2完全抑制,二硫苏糖醇(DTT)及L-半胱氨酸部分抑制,不受胰蛋白酶抑制剂抑肽酶抑制. 结论从圆斑蝰蛇泰国亚种蛇毒分离纯化的FⅩ激活剂是一种碱性糖蛋白,属于Ca2+依赖性的金属蛋白酶.     

蚯蚓脱氧核糖核酸酶纯化及酶学性质

目的:从蚯蚓组织中纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(取名为蚯蚓脱氧核糖核酸酶,简称EDNase)并研究其酶学性质.方法:采用丙酮沉淀、离子交换层析、高效液相层析、SDS-PAGE电泳,毛细管等点聚焦电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等方法.结果:经证实这种纯化方案的纯化倍数是137,酶得率为45.6%.EDNase的相对分子质量约为63 000.Mg2+,Mn2+和ca2+对酶活性有较强的抑制作用,而Na+则轻微的提高酶的活性.在pH 4.4～5.2的范围内EDNase酶活性稳定,其最适pH值为4.8.该酶的最适温度为37℃,在40℃范围内酶具有较高的稳定性.EDNase的等电点为6.20.在以小牛胸腺DNA为底物的条件下,酶的Km为1.52 g/L,Vmax为4.89 mg/(mL·min).该酶可有效降解超螺旋质粒DNA,线状λ-噬菌体DNA和细菌染色体DNA,对RNA未见任何降解作用.结论:这种酶具有独特的酶学性质,不同于以往所知的脱氧核糖核酸酶.     

肺吸虫成虫抗原组分分析

用 IE、SDS-PAGE 和 Western blot 对肺吸虫成虫抗原(PwA)成分进行分析.结果 IE 出现2条粗而明显的沉淀带。SDS-PAGE 显示29条蛋白带(分子量范围为90.0～6.0 kD),其中有10条主带,分子量分别为57、53、49.5、46、42、30、27、25、14和13 kD.经 Western blot 试验显示,肺吸虫病人血清(抗体)与 PwA 应答,可出现3条蛋白带,分子量分别为25、13和8 kD。     

短穗鱼尾葵花粉总蛋白的双向电泳及分析

目的对短穗鱼尾葵花粉过敏原蛋白质组分进行双向电泳及其结果分析,构建短穗鱼尾葵花粉蛋白双向电泳图谱,明确短穗鱼尾葵花粉的过敏原蛋白组分的分布和构建蛋白质组学数据库。方法提取短穗鱼尾葵花粉的总蛋白,取上清液进行Bradford法定量总蛋白浓度,采用13 cm IPG胶条(p H 3~10)和12%的SDS-PAGE凝胶作为二项分离胶进行双向电泳(2D)分离,银染法分析其总蛋白组成,利用Image Master2D软件对2D胶进行检测和图像分析。结果双向电泳图谱共检测到516个短穗鱼尾葵花粉蛋白点,其蛋白相对分子质量在12~174 k D,主要在10~50 k D;等电点在p H 3~10,主要分布在p H 5~8。含量最多的蛋白质其相对分子质量和等电点分别为13 k D和p H 6.258 37。含量最低的蛋白质其相对分子质量和等电点分别为29 k D和p H 3.615 79。结论成功构建较为完整的短穗鱼尾葵花粉蛋白双向电泳图谱,为建立短穗鱼尾葵花粉蛋白质组学数据库及其过敏的诊断和治疗提供了依据。     

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的应用Western blotting的方法检测蚕蛹(silkworm chrysalis)浸出液中致敏原的成份,为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据.方法取蚕蛹浸出液,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离,再转印到PVDF膜上,封闭后将血清与膜条共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应,显色底物用对氨基联苯胺.结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条,分子量在14～94 kD之间,其中主带有8条,分子量依次为80 kD、68 kD、62kD、50 kD、29 kD、28 kD、18 kD、16 kD.Western blotting结果表明,22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有6条致敏条带,其中分子量68 kD和29 kD是主要致敏组份,阳性反应率均为100%.结论蚕蛹分子量68 kD和29 kD的组份为主要致敏组份,结果可为开发适合我国特色的蚕蛹变应原提供依据.     

梭子蟹过敏原致敏组分的分析研究

目的应用免疫印迹(Western blotting)的方法分析梭子蟹[Portunus pelogicus(Linnaeus)]的致敏组分,为蟹过敏原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法取常规方法制备的梭子蟹浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用考马斯亮蓝染色分析其抗原蛋白的组分,同时用对蟹过敏的病人血清进行免疫印迹。结果SDS- PAGE显示梭子蟹可辨有19条蛋白带,分子量在13kD-90kD之间,其中主带有9条,分子量是20.9kD、24.2kD、27.1kD、29.2kD、33.7kD、38.9kD、48.7kD、74.7kD、89.1kD。Western blotting结果表明,16例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74.4kD、48.7kD的是主要致敏组分,阳性反应率均为100%。结论梭子蟹74.4kD和48.7kD组分为主要过敏原。     

刺苋花粉特异性变应原成分的分析研究

目的：分析刺苋花粉的抗原成分以及刺苋花粉特异性变应原组分,为刺苋花粉变应原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据.方法：取刺苋花粉浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离,以16例刺苋花粉过敏的病人血清为探针,进行免疫印迹（Western blotting）,检测刺苋花粉浸出液的致敏组分.结果：SDS-PAGE显示可辨蛋白条带有11条,分子量在15～80 kD之间,其中主带有9条,分子量依次为18 kD、24 kD、29 kD、35 kD、39 kD、40 kD、42 kD、62 kD、78kD.Western blotting结果表明,16份刺苋花粉过敏患者的血清全部呈阳性反应,浸出液中共有4条致敏条带,其中主要致敏蛋白的分子量是78 kD和40 kD.结论：刺苋花粉78 kD和40 kD的变应原为主要特异性变应原.     

Construction, Expression and In Vitro Biological Behaviors of Ig scFv Fragment in Patients with Chronic B Cell Leukemia

The clonotypic surface Ig receptor(SmIg)ex-pressed by malignant Bcells,idiotype,is a tumor-specific antigen and an attractive target for activei mmunotherapy.This kind of SmIg can be pro-cessed and presentedinthe context of MHCclass Iand classⅡmolecules onthe surface of the tumor.It has been shown that Id vaccination inducestumor-specific T cell responses in patients with Bcell malignancies.Such antigenic epitopes mayserve as candidates for novel peptide-vaccine strat-egies,and as tools …     

附红细胞体对Vero细胞生长的影响及其临床应用前景

目的观察附红细胞体对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)生长的影响。方法取附红细胞体感染病人的全血与vero细胞共同培养;细胞培养物进行SDS-PAGE蛋白质电泳。结果附红细胞体感染Vero细胞后,Vero细胞形态改变;蛋白质电泳图谱显示附红细胞体阳性培养物较阴性培养物多三条蛋白条带。结论附红细胞体附着Vero细胞并引起Vero细胞形态改变,附红细胞体存在分子量分别为18．4kD、25．0kD和45．0kD的三种蛋白。     

Construction, expression andin vitro biological behaviors of Ig scFv fragment in patients with chronic B cell leukemia

Summary The expression vector of SmIg scFv fragment was constructed in patient with B cell chronic lymphocyte leukemia (B-CLL) and expressed inE. coli to obtain scFv fragment, and the effect of the protein on the proliferation of stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was investigatedin vitro. Two pairs of primers were designed, and variable region genes of light chain and heavy chain were amplified by PCR respectively from the pGEM-T vectors previously constructed in our laboratory which containing light chain gene or Fd fragment of heavy chain gene. The PCR product was digested, purified and inserted into pHEN2 vector to construct the soluble expression vector pHEN2-scFv. After the induction by IPTG, the scFv protein was identified by SDS-PAGE electrophoresis and purified by Ni-NTA-Chromatography. MTT was used to determine the effect of purified protein on the proliferation of stimulated PBMCin vitro. Plasmid PCR and restriction enzyme digestion of pHEN2-scFv revealed the pHEN2-scFv vector was constructed successfully. Id-scFv protein was expressed in positive clone after induced by IPTG. SDS-PAGE analysis showed that the relative molecular weight of fusion protein was about 30 kD (1 kD=0.9921 ku), which was consistent with the theoretically predicted value. Proliferation of PBMC could be induced by purified Id-scFv. It was suggested that the expression vector of SmIg scFv fragment was constructed successfully, and scFv protein was expressed and secreted from E. coli, which could induce proliferation of PBMC. This may lay an experimental foundation for further rescarch of Id-HSP complex vaccine for B-CLL. ZHU Lijuan, femaic, born in 1976, Doctor in Charge This Project was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No, 30070325).     

单克隆抗体SZ—39识别的人脑胶质瘤细胞SHG—44膜蛋白的提取

目的：提取ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４膜抗原蛋白,为其进一步研究作准备。方法：分别以两组去污剂（１）２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４;（２）１％ＳＤＳ、１％去氧胆酸钠、１％ＮＰ－４０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ裂解ＳＨＧ－４４细胞,提取细胞蛋白,再以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法分离蛋白,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法分析鉴定。结果：ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的蛋白呈一条区带,分子量为６０ｋＤ