耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究

目的 探讨携带编码幽门螺杆菌UreB基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)经灌胃免疫在小鼠体内的分布和安全性.方法 将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌灌胃BALB/c小鼠后8周,处死小鼠,观察胃、心、肝、脾、肺和肾组织中荧光蛋白的分布,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝并分别测定其重量及HE染色.结果 在BALB/c小鼠胃、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白的表达,其他组织及对照组未检测到绿色荧光;小鼠体质量、各脏器质量、各血清肌酐和ALT含量与对照组无差异(P>0.05).结论 携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在胃和睥组织分布,对小鼠无系统毒性作用.     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的 探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响.方法 将Balh/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗.取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量.结果 生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01).结论 耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮.     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株，为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段，克隆入pET32a（＋），鉴定无误后，再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71，构建pLA71-omp载体，将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌，经卡那霉素筛选后，抽提质粒用PCR法鉴定，Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性，Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli／MS间进行穿梭，并在耻垢分枝杆菌中表达。     

一种新型的表达PPE68蛋白的重组耻垢分枝杆菌载体疫苗的构建及鉴定

目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗.方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX1-Rv3873真核表达质粒转化至耻垢分枝杆菌的感受态细胞中获...     

灵芝提取物对耻垢分枝杆菌GlmU基因表达的影响

目的研究灵芝水提取物、灵芝三萜对耻垢分枝杆菌(M.S-155)增殖曲线、GlmU基因表达、细胞壁结构的影响。方法将6×107 M.S-155接种用含有500μg/mL灵芝水提取物、灵芝三萜的LB培养基培养耻垢分枝杆菌作为实验组,6×107 M.S-155单独培养作为对照,取不同时间A600值绘制耻垢分枝杆菌增殖曲线,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹(Western blotting)检测GlmU蛋白表达情况,透射电子显微镜(TEM)观察细胞壁的形态变化。结果增殖曲线说明灵芝水提取物、灵芝三萜对耻垢分枝杆菌生长明显抑制,对应A600值组间有差异(P<0.05),而同等剂量的灵芝三萜抑菌能力更强;SDS-PAGE及Western blotting检测到相对分子质量51.5×103蛋白处蛋白实验组明显变暗(P<0.05);用TEM观察其对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响,实验组M.S-155经灵芝三萜处理后的耻垢分枝杆菌的细胞壁明显膨胀、变形。结论灵芝水提取物、灵芝三萜对M.S-155有明显的抑制作用,而其作用位点很可能就是抑制了GlmU基因的体外表达,灵芝提取物不但能够抑制M.S-155增殖而且能够影响细胞壁功能,为进一步研究灵芝应用价值奠定了基础。     

结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对耻垢分枝杆菌胞内存活的影响及相关机制

目的 明确结核分枝杆菌(MTB)异柠檬酸裂合酶(ICL)对耻垢分枝杆菌(MS)在巨噬细胞内存活的影响,并初步探讨其可能的机制.方法 构建MTB-icl基因的穿梭表达质粒pUV15-icl,电转化法导入MS中后检测MTB-ICL在MS中的表达.分别用rMS-pUV15-icl和rMS-pUV15感染鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,于感染一定时间后测定细胞内存活的细菌数,评价MTB-ICL对MS在巨噬细胞内存活的影响.分别留取上述两组巨噬细胞的培养上清液,检测干扰素γ(IFN-γ)和一氧化氮(NO)的水平,同时采用原位TUNEL技术检测两组巨噬细胞的凋亡水平,探讨MTB-ICL对MS在巨噬细胞内存活影响的可能机制.结果 RT-PCR、Western印迹和荧光显微镜检测结果证实MTB-ICL可在MS中有效表达.与rMS-pUV15比较,rMS-pUV15-icl在巨噬细胞内的存活率明显高(P＜0.01),感染后24 h和48 h,其菌落数分别为(32.78±2.90)×103和(23.33 ±2.34)×103,而rMS-pUV15菌落数分别为(14.67±2.45)×103和(2.28 ±0.25)×103.MTB-ICL对巨噬细胞产生IFN-γ和NO没有明显影响.原位凋亡检测结果显示,与rMS-pUV15感染组比较,rMS-pUV15-icl感染组巨噬细胞的凋亡水平明显下降.结论 MTB-ICL可促进MS在巨噬细胞内的存活,其机制之一可能是抑制宿主巨噬细胞的凋亡.     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

重组耻垢分枝杆菌联合抗痨药物对鼠结核病治疗作用的探讨

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,MS)与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果.方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的Balb/c小鼠40只随机分成4组.感染4周后分别用生理盐水、重组MS、INH+PZA和重组MS联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果:重组MS联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(lg CFU/g)比重组MS和INH+PZA治疗组显著降低;重组MS和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低.重组MS组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组MS联合INH+PZA治疗组和重组MS组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组.重组MS和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛.重组MS联合INH+PZA治疗组肺组织病变最轻.结论:GLS/IL-12重组MS对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组MS联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效.     

雷公藤多苷对结肠炎小鼠结肠组织IL-23、IL-17和IL-12表达的影响

目的:观察雷公藤多苷( GTT)、美沙拉嗪对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的急性结肠炎小鼠结肠组织中IL-23、IL-17、IL-12表达的影响,探讨其可能的作用机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、美沙拉嗪组、雷公藤多苷组,后3组应用TNBS建立小鼠急性结肠炎模型,模型组不作其他处理,雷公藤多苷组和美沙拉嗪组于造模前4 d开始每天给予雷公藤多苷灌胃或美沙拉嗪灌肠液灌肠直到实验结束,正常对照组不作任何特殊处理.各组小鼠均于TNBS灌肠后48 h处死,检测各组小鼠结肠组织大体、组织学损伤评分及髓过氧化物酶(MPO)活性;ELISA法检测结肠组织IL-23 p19、IL-17蛋白含量,实时荧光定量RT-PCR检测结肠组织IL-23 p19、IL-17、IL-12 p35的mRNA表达.结果:美沙拉嗪组和雷公藤多苷组小鼠结肠大体及组织学损伤记分、MPO活性明显低于模型组(P<0.05);模型组结肠组织IL-23 p19、IL-17、IL-12 p35 mRNA表达水平明显高于正常对照组、美沙拉嗪组、雷公藤多苷组(P<0.05);模型组结肠组织IL-23 p19、IL-17蛋白水平明显高于正常对照组、美沙拉嗪组、雷公藤多苷组(P<0.05),后三者间无统计学差异.结论:雷公藤多苷可能通过非选择性抑制IL-23 p19、IL-17、IL-12 p35的表达来抑制结肠炎小鼠的炎症反应,效果与美沙拉嗪类似.     

雷尼替丁对哮喘小鼠Th1/Th2功能平衡的影响

目的观察组胺H2受体拮抗剂雷尼替丁对哮喘小鼠T辅助细胞(Th1/Th2)功能性平衡的影响。方法40只BALB/C小鼠分为对照组、哮喘组、雷尼替丁2mg/kg及5mg/kg干预组。检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-12及脾单个核细胞(PMNC)中Th1类因子IFN-γ、Th2类因子IL-4的表达并分析雷尼替丁作用下IL-12与IFN-γ变化的相关性。结果对照组与哮喘组IL-12分别为(446.93±20.89,211.21±22.42)pg/ml,差异有显著性(P<0.01);IFN-γ分别为(404.91±11.78,271.58±35.35)pg/ml,差异有显著性(P<0.01);而IL-4分别为(20.30±4.93,48.26±9.39)pg/ml,差异有显著性(P<0.01)。雷尼替丁2mg/kg及5mg/kg组IL-12水平分别为(282.64±21.20,354.00±29.97)pg/ml,与哮喘组比较差异有显著性(P<0.01),IFN-γ分别为(313.25±40.54,364.44±39.79)pg/ml,与哮喘组比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01),IL-4分别为(37.70±7.47,27.76±9.63)pg/ml,与哮喘组比较有显著性(P<0.05,P<0.01)。雷尼替丁5mg/kg组细胞因子水平改变较2mg/kg组更明显(P<0.01)。在雷尼替丁组,IL-12水平与IFN-γ成明显正相关(r=0.80,P<0.01)。结论雷尼替丁可增加哮喘小鼠体内巨噬细胞IL-12的分泌,并部分纠正Th1/Th2功能平衡,其作用呈剂量相关性。推测对IL-12的上调作用可能是其影响Th1/Th2功能平衡的重要途径。     

乳酸杆菌对系统性白色念珠菌感染小鼠保护作用的实验研究

目的:探讨乳酸杆菌对系统性白色念珠菌感染的免疫抑制小鼠保护作用的机理。方法:建立系统性白色念珠菌感染小鼠模型,随机分为生理盐水对照组,低剂量、中剂量、高剂量组。造模后24h分别给予4组小鼠腹腔注射生理盐水,1×108、1×109、1×1010/ml乳酸杆菌悬液0.2ml/d×10。ELISA法检测小鼠血清IFN-γ、IL-12水平,MTT法测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性,计算小鼠肾负荷真菌数。结果:中、高剂量组小鼠血清IFN-γ、IL-12水平与生理盐水对照组、低剂量组差异明显(P<0.05),中、高剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性与生理盐水对照组、低剂量组差异明显(P<0.05),中、高剂量组小鼠肾负荷真菌数与生理盐水对照组、低剂量组差异明显(P<0.05)。结论:乳酸杆菌可通过增强系统性白色念珠菌感染小鼠细胞免疫功能对其发挥保护作用,且保护作用与乳酸杆菌的剂量有关。     

华支睾吸虫感染小鼠肝组织细胞因子动态变化的初步观察

目的观察小鼠感染华支睾吸虫囊蚴后肝脏病理学特征及IFN-γ、IL-4、IL-12表达情况,探讨IFN-γ、IL-4、IL-12在免疫调控中的作用及意义。方法分别在感染后的不同时段剖杀小鼠,取其肝脏,采用石蜡切片,H—E染色,光镜观察肝脏病理变化情况;采用SABC免疫组织化学染色法测定IFN-γ、IL-4、IL-12在华支睾吸虫感染小鼠肝脏组织中表达水平的动态变化。结果H—E染色：感染后1天,小鼠肝脏无明显变化。感染后4天,小鼠肝脏轻度肿胀,肝脏汇管区表现为轻度炎症反应。随着病程的发展病理改变趋于严重。免疫组织化学结果：Th1细胞凶子IL-12和IFN-γ的表达呈现大致相同的趋势,在感染后1周开始上升,在4周达高峰,随后下降,至第12周仍高于正常组水平（P〈0．05）。而IL-4的表达水平则自感染后第1周开始持续上升,-直持续至感染后第12周实验观察结束,且随感染时问延长而明显升高。结论免疫组织化学检测结果提示细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4的阳性表达主要在汇管区、肝小叶坏死区的淋巴细胞和巨噬细胞的胞质,肝细胞未见阳性表达。华支睾吸虫感染的免疫应答发生了由Th1免疫应答向Th2免疫应答转变的趋势;华支睾吸虫病前期Th1细胞免疫应答占优势,后期Th2细胞免疫应答占优势。     

T-ALL患儿细胞内IL-10、IL-12和IFN-γ的表达

目的：探讨细胞因子网络失衡在T-ALL白血病发病中的作用。方法：采用流式细胞仪(FCM)对T-ALL患儿白血病和非白血病T细胞内IL-10、IL-12和IFN-γ3种细胞因子进行检测。结果：IFN-γ在T-ALL患儿非白血病T细胞中显著降低，而患儿白血病细胞内未检测到。IL-12在T-ALL患儿非白血病T细胞中部分有表达，而正常对照T细胞和T-ALL患儿白血病细胞均无表达。IL-10在T-ALL患儿正常T细胞、白血病细胞和正常对照T细胞中均未检测到。结论：ALL患儿体内可能存在TH1/TH2样细胞因子产生的失平衡状态，这可能是ALL发病中的重要机制之一；推测了T-ALL发生时，体内可能通过复杂的调节机制，抑制肿瘤的发生。     

The Expression of Interleukin-23 （p19/p40） and Inteleukin-12 （p35/p40） in Psoriasis Skin

Interleukin-12 (IL-12), which is composed of p35 and p40 subunit, is a proinflammatory Th1-inducing cy-tokine. Besides IL-12, p40 can be covalently linked to a p35-related protein p19. This heterodimer is known as IL-23[1]. IL-12 promotes the development of naive T cells, whereas IL-23 mediates late-stage inflammation. In this study, the expression of IL-12p35/p40 mRNA and IL-23p19/p40 mRNA were analyzed by using reverse translation-polymerase chain reaction (RT-PCR) in order to pro…     

复发性口腔溃疡家兔外周血IL-10及IL-12水平的变化及意义

[目的]探讨复发性口腔溃疡家兔外周血IL-10及IL-12水平的变化及意义。[方法]采用免疫方法建立复发性口腔溃疡动物模型,将实验家兔分为正常组、模型组及左旋咪唑组,从实验的第7周开始,左旋咪唑组以相应药物灌胃,其他两组以生理盐水灌胃,共连续28天,取耳缘静脉检测血清IL-10及IL-12的水平。[结果]血清IL-10:模型组[(1412.80±102.40)pg.mL-1]较正常组[(1035.80±64.12)pg.mL-1]升高,差异有统计学意义(P<0.01),左旋咪唑组[(1150.83±78.33)pg.mL-1]与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);血清IL-12:模型组[(1240.10±386.99)pg.mL-1]较正常组[(2046.65±282.21)pg.mL-1]降低,差异有统计学意义(P<0.01),左旋咪唑组[(1860.85±247.01)pg.mL-1]与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。[结论]复发性口腔溃疡家兔免疫功能处于抑制状态,通过药物作用调节血清IL-10及IL-12水平,从而改善免疫抑制状态,可以达到治疗复发性口腔溃疡的目的。     

rhIL-12逆转录病毒双亚基共表达载体的转化和鉴定

目的以人白细胞介素-12（IL—12）双亚基共表达载体pL35P40SN转化大肠杆菌DH5α，并对转化载体进行鉴定。方法以构建好的IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN及其对照载体pLXPXSN转化大肠杆菌DH5α，氨苄抗性平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒并对其进行酶切及PCR鉴定。结果以XhoI酶切后鉴定，对照载体和IL-12共表达载体的条带分别在6490bp和8800bp的位置，以IL-12p35和P40引物PCR扩增后电泳鉴定，在700bp和1000bp处可见清亮电泳条带。结论含IL-12p35和p40双亚基基因的pL35P40SN载体成功转入大肠杆菌DH5α，经多项鉴定结果正确。为以其转染细胞并对IL-12的功能研究打下良好基础。     

超敏C反应蛋白、白细胞介素-12、白细胞介素-18在冠心病患者血清中的表达情况及意义

目的检测超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-18（IL-18）在冠心病患者中的表达情况,探讨其临床意义。方法选取我院100例冠心病患者作为观察组,60例正常体检成人作为对照组,检测血清中hs-CRP（免疫比浊法）、IL-12和IL-18（酶联免疫吸附实验法）的含量,比较不同临床特征中的表达差别。结果观察组hs-CRP、IL-12、IL-18的表达量显著高于对照组,hs-CRP、IL-12、IL-18的表达量与病变分型及累及血管的数量有关。线性相关性分析显示hs-CRP、IL-12、IL-18在冠心病患者中的表达呈正相关。结论 hs-CRP、IL-12、IL-18在冠心病患者中高表达,三者在冠心病发生、发展中具有重要的促进作用,hs-CRP、IL-12、IL-18的联合检测对早期判断冠心病患者病变程度具有重要意义。