人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的 通过观察不同浓度外源性一氧化氮（nitric oxide ,NO）供体硝普钠（SNP）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法 获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L、4.00 mmol/L）下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR（RT-PCR）方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1（TGF-β1）以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、 Ⅱ胶原蛋白（Col-Ⅱα1）基因的变化。结果 培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高（P<0.05）;与对照组相比,低浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L）对ADSCs的增殖无明显影响（P>0.05）,高浓度SNP（4.00 mmol/L）抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1 mRNA的表达,同时抑制Smad3 mRNA和Col-Ⅱα1 mRNA的表达。结论 在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。     

聚氨酯介导TRIB2-siRNA转染人源脂肪干细胞的体外成脂分化

目的 使用阳离子型聚氨酯(cationic polyurethane,CPU)介导TRIB2-siRNA体外转染人源脂肪干细胞沉默TRIB2基因表达,研究基因沉默效率及基因沉默对干细胞成脂分化的影响.方法 在氮/磷(N/P)为10:1的条件下,混合CPU与TRIB2-siRNA或阴性对照siRNA(NC)制备复合物,并...     

富血小板血浆对体外培养人脂肪来源干细胞增殖及成脂分化的作用

目的观察富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂能力的影响。方法用酶消化法获取人脂肪来源干细胞,二次离心法制备自体富血小板血浆,将细胞分为实验组与对照组,实验组以含5%、10%、20%自体富血小板血浆的条件培养液干预,对照组不进行富血小板血浆干预。观察细胞形态学,以XTT比色法测定细胞增殖状况,油红O染色检测细胞成脂活性。结果富血小板血浆实验组较对照组细胞形态饱满、密度增大;XTT比色法显示实验组细胞增殖明显(P<0.01);实验组油红O染色阳性率较对照组增高明显(P<0.01)。结论富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂分化活性具有显著的促进作用。     

子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究

目的研究子宫内膜基质干细胞在特定培养条件下向成骨及成软骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取15例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织,磁珠分选法获得子宫内膜基质干细胞,用成骨诱导和成软骨诱导培养基诱导,组织化学染色检测其向成骨和成软骨细胞分化的情况。结果从人子宫内膜组织中培养出基质干细胞,能稳定增殖传代。在成骨诱导培养基诱导下子宫内膜基质干细胞茜素红染色出现钙结节;成软骨诱导培养基诱导下,阿利新兰染色呈阳性。结论从子宫内膜组织中可获得具有多向分化潜能的基质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞和成软骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化研究

目的 体外分离培养和鉴定小鼠脂肪源性干细胞,向成骨方向分化,为后续的实验选取合适的种子细胞奠定基础.方法 从白色脂肪组织中分离培养脂肪源性干细胞,应用流式细胞仪分析其表面的标记.分别通过碱性磷酸酶、茜素红和油红-O染色方法染色方法鉴定向成骨和成脂方向分化.结果 脂肪源性干细胞高表达表面标记CD29、CD44,并且能够向成骨和成脂方向分化.结论 利用胶原酶消化法,在小鼠脂肪组织中成功分离、培养出脂肪源性干细胞,获得的细胞具有多向分化潜能,为后期组织工程技术修复骨组织,提供了坚实的实验基础.     

人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的:观察人脂肪基质干细胞(ADSCs)体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:(1)人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增.(2)取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记;成脂和成软骨诱导分化.(3)倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝(AB-PSA)染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况;RT-PCR检测相关标志基因表达.结果:(1)体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定.(2)经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RT-PCR检测到有Leptin、PPAR-γ表达;经成软骨诱导,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT-PCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达.结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞.     

脂肪来源干细胞的基础研究及成脂应用进展

目前已经证实可以从脂肪组织中获取具有多向分化能力的细胞[1-2],这些细胞一般被称之为脂肪来源干细胞(adiposederived stem cells,ADSC)、脂肪来源基质细胞(adipose derivedstromal cells,ADSC)、脂肪来源的间充质祖细胞(adipose derived progenitor cells)或前脂肪细胞(preadipocytes),然而这些不同的     

诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展

由创伤或其他病因引起的关节软骨病变通常难以自愈,且目前临床上的治疗方法疗效欠佳。脂肪干细胞 (adipose derived stem cells,ADSCs)是一种来自脂肪组织、具有多向分化潜能的干细胞,基于ADSCs成软骨分化能力的 组织工程学疗法为关节软骨缺损的修复再生提供了新的思路。体外诱导ADSCs分化成软骨的方法主要是采用生长因 子和支架材料模拟体内微环境,进而促进ADSCs向软骨细胞分化,其相关应用已取得初步成功。     

Tribbles同源蛋白3抑制人脂肪间充质干细胞成脂向分化

目的:研究Tribbles同源蛋白3(Tribbles pseudokinase 3, TRIB3)在人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)成脂分化中的调控作用,为提高hASCs成脂向分化能力、并为基于hASCs的脂肪组织工程与软组织缺损修复提供新靶点与新思路。方法:通过慢病毒转染建立TRIB3稳定敲低(TRIB3敲低组)和过表达(TRIB3过表达组)的hASCs细胞系,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹实验(Western blot)检测慢病毒转染hASCs的转染效率和效果。通过油红O染色和定量、qRT-PCR等实验方法,检测敲低、过表达TRIB3对hASCs成脂分化能力的影响。结果:TRIB3敲低慢病毒转染后,TRIB3敲低组hASCs中TRIB3 mRNA表达量较对照组下降84.3%(P<0.01), TRIB3蛋白表达也显著下降,表明成功构建了TRIB3敲低的hASCs细胞系;TRIB3过表达慢病毒转染后,TRIB3过表达组TRIB3 mRNA表达量较对照组增高约1.6倍(P<0.01),TRIB3蛋白表达也显著升高,表明成功构建了TRIB3过表达的hASCs细胞系。在此基础上,油红O染色显示,TRIB3敲低的hASCs成脂诱导后胞浆内红色脂滴明显增多,定量结果表明TRIB3敲低组油红O着色较对照组显著增多(P<0.01)。与之相反,TRIB3过表达的hASCs成脂诱导后胞浆内红色脂滴明显减少,定量结果表明TRIB3敲低组油红O着色较对照组显著减少(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,敲低TRIB3的hASCs成脂诱导后,成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)和白细胞分化抗原36(cluster of differentiation 36, CD36)mRNA水平显著升高(P<0.01);TRIB3过表达的hASCs成脂诱导后成脂分化相关基因PPARγ、CD36和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA水平明显下降。结论:TRIB3能够调控hASCs成脂分化能力,敲低TRIB3促进hASCs成脂分化,过表达TRIB3抑制hASCs成脂分化。     

体外共培养诱导脂肪干细胞向软骨表型细胞分化及鉴定的实验研究

目的:探讨脂肪干细胞经共培养诱导为软骨表型细胞的可行性,为软骨组织工程种子来源提供的新途径。方法:分离培养日本大耳白兔的脂肪干细胞及肋软骨细胞,将脂肪干细胞与软骨细胞分层共培养及脂肪干细胞单独培养于6孔板中2周。通过safranin-O染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫化学染色对诱导后细胞表型进行鉴定,RT-PCR检测诱导后Ⅱ型胶原基因表达情况。结果:共培养诱导2周后的脂肪干细safranin-O染色和甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原基因表达接近于正常软骨细胞。结论:脂肪干细胞经与软骨细胞共培养后,可以诱导为软骨表型细胞。     

成人脂肪基质细胞体外诱导星形胶质细胞的形态学和超微结构研究

目的 研究成人脂肪基质细胞(ADSC)诱导分化前、后细胞的生物学特性和超微结构特征.方法 体外分离、培养ADSC,应用化学诱导剂对其进行诱导,倒置显微镜下观察ADSC及其诱导分化细胞的形态;免疫细胞化学检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况;Real-time PCR检测ADSC诱导分化前、后Nestin、GFAP基因mRNA的表达情况;透射电镜观察诱导分化细胞的超微结构.结果 体外培养的ADSC形态类似成纤维细胞,可在体外稳定扩增10代以上.诱导分化的细胞具有星形胶质细胞的超微结构特征;Nestin在细胞质中呈阳性表达,GFAP在细胞质及细胞核中均呈阳性表达.两种蛋白的阳性表达率在诱导14d时达到高峰分别为:Nestin(14.4 ±3.6)%,GFAP(87.3±5.3)%,此后两种蛋白的阳性表达率保持不变.Nestin及GFAP基因mRNA在诱导前及诱导后(1 d、7d、14d、20d)各时间点均有表达,且mRNA的平均相对浓度随着诱导时间的延长逐渐增高,Nestin在诱导后14d达到最高水平,GFAP在诱导后20d达到最高水平(P<0.05).结论 成人脂肪基质细胞的胞质中具有神经干细胞标志物Nestin的基因遗传物质,可将其诱导分化为具有成熟星形胶质细胞超微结构及GFAP蛋白、基因表达的细胞.     

脂肪干细胞成骨分化的研究进展

随着骨组织工程研究取得较好的发展,涌现出各类种子细胞。脂肪干细胞,来自脂肪组织,具有诸多的优势,成为骨组织工程研究的热点种子细胞之一。本文综述了脂肪干细胞成骨分化的诱导方法、过程、验证方法、影响成骨分化的供体因素和实验因素,并对其未来研究方向进行了展望。