大鼠骨髓间充质干细胞的培养、扩增与鉴定

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法:采用密度梯度离心法和贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果:原代MSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状排列.传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速,倍增时间约45.5 h.流式细胞术鉴定表明,培养的第3代和第5代MSCs CD44、CD29阳性,CD45和CD34阴性.结论:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功分离和培养大鼠的骨髓MSCs,MSCs可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

The Research on Chimeric MHC-Ⅰ Gene Responsing to Allogeneic Dendritic Cells

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.     

成人骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性

目的：探索体外培养脑出血后遗症患者骨髓基质细胞(BMSCs)的方法及扩增后的生物学特性。方法取脑出血后3个月以上患者髂骨骨髓组织,去除淋巴细胞后采用静置贴壁培养法接种培养,经多次换液纯化。在倒置相差显微镜下观察细胞形态,取第3、6代应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD105因子的表达。结果倒置相差显微镜下接种48 h后,发现少数细胞贴壁,呈梭形,6~8 d后细胞形成集落。传代后,细胞形态趋于一致,可成漩涡状。流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性,而CD29、CD105阳性。结论体外密度梯度离心法和贴壁静置可以获得大量高度均一的表型符合骨髓基质细胞的细胞。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。     

分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制。方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组)。分别感染BALB/c小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞。分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数。结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17%。单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P<0.01)。结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低。     

新生小鼠大脑皮质神经细胞体外培养方法及鉴定

目的 探索用24 h内新生C57BL/6小鼠大脑皮质进行神经细胞体外培养的方法.方法 取出生24 h内新生C57BL/6小鼠大脑皮质,胰蛋白酶消化,等体积的基础培养基终止消化,机械性吹打通过细胞过滤器获得单细胞悬液,接种细胞,24 h后更换无血清培养基,每3～4 d半量换液.神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)抗体免疫组化方法鉴定神经细胞的纯度.结果 细胞在培养12 h后开始贴壁,24 h开始分化生长成梭形.大部分神经细胞于第2天长出突起,第3天神经细胞间形成复杂的联系,第7天神经细胞发育基本成熟.经NSE鉴定,培养细胞中神经细胞纯度可达90%以上.结论 无血清体外原代神经细胞培养法简便易行,相对于有血清培养法具有较大的优越性.     

MSCs联合来氟米特对异基因鼠B细胞的免疫调节

目的 探讨体外骨髓间充质干细胞(MSCs)联合来氟米特(LEF)对BALB/c鼠B细胞的免疫调节作用.方法 从5～6周龄BALB/c鼠骨髓中分离培养MSCs,并通过其形态的均一性及流式细胞术(FCM)检测其表面标志以鉴定其纯度.用EZ-SepTM Mouse 1X分离脾脏淋巴细胞,经脂多糖(LPS)刺激,并与LEF和/或MSCs作用.分为A组(脾细胞)、B组(脾细胞 LEF)、C组(脾细胞 MSCs)和D组(脾细胞 LEF MSCs).用MTT法检测B细胞的增殖.FCM检测B细胞CD69 、CD86 表达情况,以及B细胞凋亡情况.结果 MSCs对B细胞增殖有明显抑制作用,MSCs联合LEF后抑制作用更强.C组吸光值(OD值)为0.303±0.016,明显高于D组的0.250±0.013(P<0.01).C组CD86 B细胞百分率较A组明显降低[(76.17±1.13)%vs(87.57±1.66)%](P<0.01).D组CD86 B细胞百分率显著低于C组[(60.94±1.22)%vs(76.17±1.13)%](P<0.01).MSCs和/或LEF对B细胞CD69 的表达和B细胞凋亡均无显著影响.结论 MSCs联合LEF对BALB/c鼠B细胞有免疫负调节作用,但机制复杂,可能与抑制B细胞增殖、干预B细胞不同时期活化有关.     

骨髓间充质干细胞对胶质瘤C6细胞增殖的影响

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对胶质瘤C6细胞体外增殖的影响。方法从大鼠骨髓中分离MSCs,体外培养和鉴定。取MSCs培养上清液,按照1/5,2/5,3/5的比例加入到C6培养基中,用MTT实验和BrdU标记指数(BrdU LI)评估C6细胞增殖。将MSCs与C6按照1∶1,1∶2,2∶1比例共培养。结果大鼠MSCs贴壁生长,有较强的增殖能力。经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,分化为神经元或胶质细胞样细胞。C6培养基中加入MSCs培养上清液后,活性受到明显抑制,BrdU LI明显减低(P<0.05)。C6与MSCs共培养后,生长明显受到抑制,BrdU LI明显降低,尤其在MSCs周围,表现更加明显。结论大鼠MSCs在体外有明显的抑制胶质瘤C6增殖作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)体外分离培养方法及其生物学特性。方法在无菌条件下取SD大鼠股骨、胫骨,采用差速贴壁法分离培养bMSCs,通过传代培养进一步纯化扩增。倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定bMSCs表面标志。结果镜下bMSCs大小均一,呈梭形、多角形成纤维细胞形态,呈旋涡状生长。第3代bMSCs纯度可达97%以上,其细胞表型CD29,CD44,CD105和CD166呈阳性表达,CD34,CD80和CD86呈阴性表达。结论采用差速贴壁法分离培养的大鼠bMSCs纯度高、扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系。