从噬菌体肽库中筛选弓形虫抗原模拟表位初探

以弓形虫感染兔血清免疫球蛋白（Ig）作为靶分子，免疫筛选噬菌体随机7肽库和12肽库。经3轮筛选，随机挑取70个噬菌体克隆用ELISA检测其特异性，共获得43个阳性克隆。对23个ELISA反应较强的克隆进行测序，根据序列分析选择有代表性的克隆A7作为模拟表位抗原进行ELISA检测。对47份弓形虫感染兔血清进行ELISA检测，结果32份为阳性，敏感性为68.1%；155份健康人血清中弓形虫抗体呈阳性者10份，特异性为93.5%。从噬菌体随机肽库中能筛选到弓形虫抗原模拟表位有诊断弓形虫病的潜在价值。     

用随机肽库筛选胃癌相关抗原MGb2—Ag模拟肽表位

的　运用肽库筛选技术寻找胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２ 所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位。方法　以胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２ 作为筛选配基，对呈现于噬菌体衣壳蛋白ｐⅧ上的两个九肽库进行了亲和富集和免疫筛选；阳性克隆用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹证实结合活性；随机抽取部分阳性克隆进行了ＤＮＡ 测序分析。结果　经ＤＮＡ 测序分析推导出相应的氨基酸序列并加以比较分析，得到具有保守性的表位信息。结论　具有相对保守性的ＶＣＸＸＤＧＶ 可能为胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２所识别的表位基序。     

噬菌体表达短肽模拟旋毛虫抗原表位及其抗血吸虫保护性免疫研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选出模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。　方法　以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基 ,亲合筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ;混合噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染后第 4 5天剖杀小鼠 ,观察减虫和减卵效果。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效的富集 ,第三轮洗脱噬菌体的产量约为第一轮的 15 0倍。随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 1个克隆能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率与减卵率分别为 4 2 8%与 6 6 3% (P <0 0 0 1)。　结论　利用噬菌体随机肽库技术可获得模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导明显的抗血吸虫的保护性免疫。     

应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位

目的从噬菌体12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。方法将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白(Ig)作为靶分子筛选噬菌体随机12肽库。经过5轮淘筛，随机挑取24个蓝色噬菌斑进行扩增，以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值。结果24个克隆中有12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别，其中有2个克隆(P5、P6)具有较好的特异性和敏感性，可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。结论应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位，为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据。     

应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位

目的　从噬菌体 12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。　方法　将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白 (Ig )作为靶分子筛选噬菌体随机 12肽库。经过 5轮淘筛 ,随机挑取 2 4个蓝色噬菌斑进行扩增 ,以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值。　结果　 2 4个克隆中有 12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别 ,其中有 2个克隆 (P5、P6)具有较好的特异性和敏感性 ,可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位。　结论　应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位 ,为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据。     

应用噬菌体随机肽库研究细粒棘球蚴抗原模拟表位

用抗细粒棘球蚴B抗原(EgB)多克隆抗体筛选噬菌体随机7肽库。经过5轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的4.15×10-5增加到第5轮的4.30×10-2,说明阳性克隆得到富集。随机挑取60个蓝色噬菌斑进行扩增,对其核苷酸序列进行测定分析并与EgB进行同源性比较。采用ELISA法对阳性噬菌体与抗EgB多克隆抗体结合特性进行检测,共检测出45个与抗EgB多克隆抗体结合的克隆株(阳性率为75%),其递呈的七肽序列与EgB的同源性低。采用ELISA法检测所选多肽对棘球蚴病所致过敏性休克患者抗血清的反应性,结果显示,细粒棘球蚴病患者抗血清与45个阳性噬菌体克隆反应的吸光度(A410值)比其与7肽库反应的A410值大2倍以上,该45个阳性噬菌体克隆与EgB多克隆抗体的结合是特异的。提示成功分析细粒棘球蚴囊液B抗原肽表位以及模拟表位。     

噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的噬菌体克隆 ,并探讨其免疫保护效果。方法　用紫外线致弱尾蚴免疫兔血清IgG筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体外壳蛋白Ⅲ表达的随机 7肽库 ,三轮免疫筛选后获得的噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染 45d后剖杀 ,观察减虫和减卵效果。结果　经三轮筛选 ,特异性结合的噬菌体富集增加了 10 0多倍 ,随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 2个克隆能与致弱尾蚴免疫兔血清IgG特异性反应。混合噬菌体克隆免疫小鼠试验的减虫率与减卵率分别为 33.5 7%和 5 6 .0 7% (P均 <0 .0 0 1)。结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟致弱尾蚴特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

用噬菌体肽库筛选SjC-TPI的模拟抗原表位

目的　筛选日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 (SjC TPI)分子的模拟抗原表位 ,研究其免疫学特性。方法　用纯化的抗重组SjC TPI抗体 (IgG)筛选 12肽库 ,获取SjC TPI的模拟抗原表位 ,并研究其抗原特性。结果　获得SjC TPI分子的两个模拟抗原表位M1和M2 ,Westernblotting分析结果表明由这两个模拟抗原表位免疫小鼠产生的免疫血清能识别SjC TPI分子和含此两抗原表位的噬菌体外壳蛋白。DNA测序结果显示这两个模拟抗原表位的氨基酸序列与SjC TPI无同源性。结论　本研究获得的模拟抗原表位M1及M2为SjC TPI的空间构型抗原的模拟表位 ,具有较好的抗原性     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌O9抗原的模拟表位

目的　用生物素标记沙门氏菌O9单克隆抗体 (3- 4 7-O)作为分子探针 ,从两个九肽噬菌体展示文库中筛选鉴定该抗体所识别的抗原模拟表位 ,从而为模拟多糖的多肽疫苗或编码该模拟表位的DNA疫苗研制奠定基础。方法与结果　经过三轮的亲和筛选 ,得到了两个能与O9单抗反应的强阳性单克隆扩增物gm6 2和 gm6 8,其序列分别为SHHVRGGGG和YQKWYLPKS。竞争ELISA实验表明 ,10 10转导单位噬菌体 gm6 8对肠炎沙门氏菌与 3- 4 7-O结合的抑制率达到 6 5 % ,而噬菌体 gm6 2的抑制率仅为 2 0 % ,且 gm6 8可以诱导产生针对沙门氏菌O9的抗体 ,而gm6 2则不能。 结论　实验结果显示九肽YQKWYLPKS是具有免疫原性的O9抗原模拟表位。     

抗弓形虫单克隆抗体免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的　探讨自制的抗弓形虫单克隆抗体 (McAb)相应抗原的分子结构机制 ,为弓形虫疫苗的研制寻找有效抗原提供依据。方法　用自制的抗弓形虫速殖子的McAb免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR鉴定并测序分析。结果　 2个McAb第一轮分别获得 6个和 3个阳性克隆。分别进行第 2轮筛选 ,选取其中持续阳性最强的2个进行体外剪切 ,提取质粒DNA并进行PCR扩增和序列测定 ,经核苷酸同源性比较 ,可能为 2个新基因 ,其中 7C3-C3筛选的基因命名为WX2 (GenBank登录号为 :AY2 38892 ) ,2B9-G1筛选的基因命名为WX(GenBank登录号为 :AY2 0 8994 ) ,并用蛋白质分析软件对新基因编码的蛋白质结构和功能进行预测。结论　自制的具有一定保护性效果的McAb免疫筛选获得的阳性克隆插入基因片断的表达产物 ,可能具有抵抗弓形虫感染的作用 ,值得进一步深入研究。     

大鼠感染血清免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法用弓形虫RH株速殖子感染大鼠,分离其血清作为探针筛选弓形虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。结果从cDNA文库4×105~5个噬菌斑中筛选出13个阳性克隆,其插入片段大小分别为0.45～2.4kb。对L1、L2、L4和L5四个克隆进行测序,将所得序列查询基因库,结果,克隆L2与弓形虫P24主要抗原基因序列相同,L4与蔗糖丙酮酸磷酸激酶具有同源性,L1无任何相匹配的序列,为未曾报告过的新基因(GenBank登录号为AY180109),命名为T.g-R1。T.g-R1编码134个氨基酸的非跨膜蛋白。PROSCAN分析显示T.g-R1含有2个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个肉豆酸酰化位点,1个微体细胞C端靶信号。L5为一小片段,无完整编码读框。结论阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制提供又一途径。     

大鼠天然抗体相关的弓形虫抗原基因的免疫筛选与克隆

目的　研究大鼠对弓形虫感染的天然抗性分子 ,为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用正常大鼠血清作为探针筛选弓形虫速殖子cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。结果　从cDNA文库 2× 10 5个噬菌斑中筛选出 5个阳性克隆 ,其插入片段大小分别为 0 5 5～ 1 8kb。对P1、P4、P6和P8四个克隆进行测序 ,将所得序列查询基因序 ,结果显示 :P8与弓形虫棒状体蛋白 2 (ROP2 )基因相同。P4为弓形虫的新基因序列 (GenBank中的登录号为AY34916 2 ) ,命名为T .gP4。T .g -P4编码 96个氨基酸的跨膜蛋白。PROSCAN分析显示T .g -P4含有 4个蛋白激酶C磷酸化位点 ,3个N -肉豆酸酰化位点 ,1个核糖体蛋白L2 9信号。P1和P6为新基因片段。阳性克隆的分子鉴定正在进行中。结论　阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制奠定基础。     

Toxoplasma gondii infection among chronic hepatitis C patients:A casecontrol study

Objective:To determine the detection rate of anti-Toxoplasma gondii(T.gondii) IgG and IgM in chronic HCV patients attending the Department of Tropical Medicine Mansoura University hospital in Egypt.Methods:This study included 120 adult chronic HCV patients.81 decompensate cirrhosis(late-stage)and 39 chronic HCV non cirrhotic patients(early-stage) and40 healthy blood donors as controls.Serum samples uere examined for anti-Toxoplasma IgM and anti-Toxoplasma IgG antibodies by ELISA.Real-time RT-polymerase chain reaction assay was done for quantitation of hepatitis C virus.Results:Anti-T.gondii IgG antibodies were detected in 75(92.6%) of 81 late-stage cirrhotic patients.30(76.9%) of the 39 chronic HCV non cirrhotic patients(early-Stage) and in 6(15ft) of 40 controls with statistically significant difference(P0.001).Anti-T.gondii IgM antibodies were found in 11(13.6%) in late stage patients,5(12.8%)in early stage and in 3(7.5%) of controls with no statistical significant difference(P=0.610).There was no correlation between stage of fibrosis and IgM or IgG antibodies positivity in our studied groups(P=0.526).High IgG levels significantly correlated with high viral load(P=0.026).Conclusions:Our findings suggest that the serious opportunistic T.gondii infection represent a potential significant risk for chronic HCV patients.So.toxoplasmosis should be considered in their investigations and follow-up.     

弓形虫疫苗及其保护性研究现状

本文对近年来研制的弓形虫疫苗的种类、方法及其免疫保护性进行了综述，以期为弓形虫疫苗的进一步研究提供参考。     

弓形虫排泄/分泌抗原的免疫保护性研究进展

弓形虫排泄/分泌抗原(ESA)是虫体在黏附、侵入宿主细胞及在纳虫泡中寄生过程中分泌、排泄的抗原物质。近期的研究主要通过体外培养法获取ESA,并对其进行分子生物学及免疫学特性研究。ESA中的多种成分具有较强的免疫原性,可诱导细胞及体液免疫应答并产生抗弓形虫感染的保护作用。研究ESA的免疫保护作用对揭示弓形虫带虫免疫及免疫逃避机制有重要意义,对弓形虫病的诊断及免疫预防、疫苗候选抗原的制备具有重要价值。     

弓形虫侵入宿主细胞的研究进展

在弓形虫侵入宿主细胞的过程中，弓形虫表面抗原（surface antigen，SAG）、微线体蛋白（micronemes，MIC）、棒状体蛋白（rhoptry protein，ROP）、致密颗粒抗原（dense granules antigen，GRA）及钙离子起着重要的作用，蛋白激酶则对弓形虫侵入宿主细胞过程所必需的蛋白质的正确折叠及加工起作用。本文对此进行了简单综述。     

弓形虫基因分型研究进展

弓形虫感染可引起严重的弓形虫病, 而不同宿主感染的弓形虫株基因型差异较大, 不同基因型弓形虫株的致病力及药物敏感性亦存在较大差异。目前, 对弓形虫基因型的分析多选用限制性片段长度多态性PCR（PCR?RFLP）、 高度重复序列PCR、 多重PCR和巢氏PCR等技术, 扩增位点多选择B1、 SAG2、 HSP70、 GRA6等遗传标记。传统的弓形虫基因型主要有3个, 随着研究的不断深入, 越来越多的基因型被发现。本文就弓形虫基因分型研究进展进行综述。