氯化锂抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的机制研究

目的：探讨LiCl对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭能力的影响, 及其对侵袭关键因子NGAL表达的调控。方法： LiCl处理后, MTT测定细胞活力, 光镜观察细胞伪足形成; Transwell观察细胞侵袭能力的变化; 实时定量PCR及Western blotting观察NGAL在转录和翻译水平的表达; 使用小分子药物Bay117082 （NF-κB通路抑制剂） 和FH535 （Wnt/β-catenin通路抑制剂） 处理细胞, 检测关键通路对NGAL表达的调控。结果： 在浓度低于10 mmol/L时, LiCl对细胞活性的影响无显著性差异。5 mmol/L或10 mmol/L LiCl处理细胞24 h后, 细胞形态发生明显改变, 其伪足形成受到影响, 但在NHE1抑制剂Cariporide作用下, 细胞伪足破坏的情况有所减轻; Transwell结果显示5、 10 mmol/L LiCl分别处理细胞24 h后, 细胞的侵袭能力受到明显抑制。实时定量PCR和Western blotting结果显示, LiCl处理后NGAL mRNA和蛋白表达均明显下降, 表明LiCl对NGAL的调控可能始于转录水平。小分子药物处理分别使Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路抑制后, NGAL的表达均受到明显抑制, 表明这两条通路都参与了NGAL表达的调控。结论： LiCl通过抑制NF-κB调控NGAL的表达, 抑制伪足形成以及细胞侵袭。     

circNEIL3 通过靶向miR-4784 调控乳腺癌MDA-MB-231 细胞的增殖、迁移和侵袭

目的：研究环状RNA nei 样DNA糖化酶3（circNEIL3）和微小RNA（miR）-4784 对乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集2018 年1月至2019 年12月在济南市中西医结合医院经组织病理诊断为乳腺癌并行手术切除的45 例乳腺癌患者的癌组织和配对癌旁组织,qPCR 法检测乳腺癌组织、癌旁组织中circNEIL3 和miR-4784 的相对水平。将circNEIL3 的小干扰RNA（si-circNEIL3）、miR-4784 模拟物、si-circNEIL3+miR-4784 抑制物分别转染MDA-MB-231 细胞,采用CCK-8法、平板克隆实验、划痕愈合实验、Transwell 实验检测circNEIL3和miR-4784 表达对细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭的影响。双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down 实验检测circNEIL3和miR-4784 之间相互作用。结果：乳腺癌组织中circNEIL3呈高表达（P<0.05）,miR-4784 呈低表达（P<0.05）。干扰circNEIL3显著降低MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成数、划痕愈合率以及侵袭数（均P<0.05）。过表达miR-4784 显著降低MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成数、划痕愈合率以及侵袭数（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验、RIP 和 RNA pull-down 实验均证实circNEIL3 与miR-4784 可直接结合,干扰circNEIL3 能明显上调miR-4784表达（P<0.05）,过表达circNEIL3 能明显下调 miR-4784 表达（P<0.05）。抑制miR-4784 表达部分逆转干扰circNEIL3对MDA-MB-231 细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用（P<0.05）。结论：干扰circNEIL3通过靶向上调miR-4784表达抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭。     

RNA干扰抑制MTA 1的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响

目的:探讨通过RNA干扰技术抑制MTA1的表达及对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和细胞周期的影响。方法:建立3种稳定表达靶向MTA1的shRNA的MDA-MB-231细胞系。通过反转录-聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫组化法验证基因表达的抑制效果;采用细胞计数法及噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)法检测细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果:MTA1基因被抑制后,其mRNA表达明显下降,RT-PCR结果显示,稳定转染3种重组质粒后,MTA1mRNA水平较对照组分别下调了70.07%、82.40%和63.44%;同时,MDA-MB-231细胞的生长明显受抑制,与对照组细胞相比,细胞计数示细胞数目明显减低;MTT分析示细胞增殖下降,流式细胞分析示细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:在MDA-MB-231细胞中,抑制MTA1的表达可有效抑制细胞生长并导致细胞周期的阻滞;利用RNA干扰技术抑制MTA1的表达可能会成为一种有效的乳腺癌基因治疗手段。     

Ghrelin促进乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的分子机制

目的:探讨生长激素释放肽（Ghrelin）促进乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的分子机制。方法:乳腺癌细胞MDA-MB-231经Ghrelin、Ghrelin受体（growth hormone secretagogue receptor,GHSR)抑制剂［D-Lys3］-GHRP-6或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）处理后,MTT或BrdU实验检测MDA-MB-231细胞的增殖能力;Western blot检测MDA-MB-231细胞GHSR表达及mTOR、p70S6K和S6磷酸化水平。结果:增殖实验结果表明Ghrelin增强MDA-MB-231细胞增殖能力;Western blot检测发现Ghrelin激活MDA-MB-231细胞mTOR、p70S6K和S6磷酸化,［D-Lys3］-GHRP-6或Rapamycin消除Ghrelin促进MDA-MB-231细胞增殖效应,同时抑制Ghrelin诱导的mTOR、p70S6K和S6磷酸化。结论:Ghrelin通过与GHSR结合激活MDA-MB-231细胞mTOR/p70S6K/S6信号途径促进MDA-MB-231细胞增殖。     

乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、黏附及侵袭的影响

目的:研究乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)对乳腺癌细胞增殖、凋亡、黏附和侵袭能力的影响.方法:首先,从6例乳腺癌病人肿瘤及癌旁正常乳腺组织块分别分离培养成对的CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs).然后,通过Transwell小室将CAFs或NFs与乳腺癌MDA-MB-231细胞体外共培养,进行增殖(MTT)、侵袭、黏附实验及流式细胞仪细胞凋亡检测.结果:MDA-MB-231与CAFs或NFs共培养后乳腺癌细胞的增殖活性显著增强(P＜0.05).与NFs相比,这种差异在同CAFs共培养组更为明显(P =0.011).与CAFs共培养之后,MDA-MB-231的早期凋亡显著减少(P=0.026);而与NFs共培养之后则无显著差异.CAFs或NFs对MDA-MB-231细胞的细胞周期和晚期凋亡无明显影响.与CAFs或NFs共培养24小时后,MDA-MB-231细胞的侵袭、黏附能力明显增强,黏附数目为(34.7±4.84)个/视野(CAFs)和(20.16±0.09)个/视野(NFs),(P =0.000);侵袭数为(89±4.62)个/视野(CAFs)和(81.6±6.08)个/视野(NFs),(P＜0.05).结论:CAFs能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、减少其早期凋亡;同时对乳腺癌细胞的黏附和侵袭能力有促进作用.可是NFs的作用较CAFs为弱.有关CAFs影响乳腺癌肿瘤细胞的生物学特性的机制有待于进一步研究.     

TNF-α对人乳腺癌MCF-7细胞株CD44表达以及细胞侵袭性的影响

目的:检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7中CD44s、CD44v3和CD44v6的表达水平的变化,及对细胞侵袭能力的影响.方法:采用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7中CD44s、CD44v3和CD44v6的表达情况,了解TNF-α对CD44各亚型表达水平的影响;Transwell检测TNF-α作用前后人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭力的变化情况.结果:TNF-α作用后,MCF-7细胞株CD44s mRNA表达下降,CD44v3 mRNA和CD44v6 mRNA的表达上升.相应蛋白表达与mRNA水平呈现一致性改变,其中CD44s蛋白表达下降,CD44v3蛋白和CD44v6蛋白表达上升;TNF-α作用后细胞侵袭力提高(P＜0.001).结论:在人乳腺癌细胞株MCF-7中,TNF-α可能通过影响CD44各亚型mRNA和蛋白表达水平,进而促进肿瘤细胞的侵袭能力.     

不同药物麻醉的乳腺癌患者血清对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的:探究不同药物麻醉的乳腺癌患者血清对体外乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法:收集我院2016年2月至2017年12月期间采用丙泊酚麻醉的乳腺癌患者血液样本28例，七氟醚麻醉的乳腺癌患者血液标本32例，乳腺癌术后镇痛使用曲马多的患者血液样本25例，未使用任何麻醉药的普通乳腺癌患者血液样本20例。将血清作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，采用流式细胞法检测细胞的凋亡率，ELISA法检测各组细胞中半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8）的表达情况。结果:流式细胞法检测结果显示，使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡率；ELISA结果显示，使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-3的表达（P＜0.05），且各组之间无统计学差异（P＞0.05）；而使用丙泊酚和七氟醚麻醉的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达（P＜0.05），曲马多却未能影响乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达（P＞0.05），丙泊酚和七氟醚组与曲马多组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:使用丙泊酚、七氟醚麻醉和曲马多术后镇痛的患者血清均能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡率及caspase-3的表达；而使用丙泊酚和七氟醚麻醉的患者血清能够显著提高乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达，曲马多对乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-8的表达没有明显影响。     

桔梗皂苷D诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

目的:研究来自桔梗的天然单体化合物桔梗皂苷D(platycodin D,PD)对高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,初步探索其可能的作用机制.方法:以不同浓度(0、2.5、5、10 μmol/L)PD处理乳腺癌MDA-MB-231细胞后,采用MTT法检测细胞增殖率并计算IC50值,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平.结果:PD呈剂量依赖性显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.01),作用72 h的IC50值为(7.30±2.67) μmol/L.与对照组相比,10 μmol/L的PD可显著促进MDA-MB-231细胞的凋亡(P＜0.05).PD激活了caspase家族蛋白,上调有活性的cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9的表达,下调无活性的caspase-8和caspase-9的表达;PD同时减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达,使Bcl-2/Bax的比值降低.研究还发现PD使突变型P53蛋白的表达减少、E2F1的表达增加.结论:PD抑制乳腺癌细胞增殖具有明显的抗肿瘤效应,而诱导凋亡的发生可能是其发挥抗肿瘤效应的机制之一.     

环加氧酶-2 通过调控EMT促进乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭

[摘要] 目的：探讨环加氧酶-2（COX-2）在乳腺癌转移中的作用及其可能的机制。方法：收集从2015 年10 月至2018 年4 月在云南省肿瘤医院接受乳腺切除术的患者中获得的原发乳腺癌组织和脑转移乳腺癌组织临床病理样本共45 例,其中原发30 例、脑转移15 例。采用qPCR检测COX-2 在原位乳腺癌和脑转移乳腺癌组织中的表达。将COX-2 过表达重组病毒（LV6-COX2）或敲减COX-2 重组病毒（LV3-COX2 shRNA1、LV3-COX2 shRNA2）感染人乳腺癌MDA-MB-231 细胞并获得稳转细胞株后,CCK-8法检测COX-2 表达对MDA-MB-231 细胞增殖的影响,划痕实验和Transwell 法检测对MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭的影响。qPCR和WB实验分析各组细胞中COX-2 mRNA和蛋白的表达水平,qPCR检测COX-2 表达对MDA-MB-231 细胞内EMT相关基因表达的影响。结果：COX-2 表达水平在脑转移乳腺癌患者组织中显著高于原位乳腺癌组织（P<0.01）;并且与乳腺癌患者肿瘤TMN分期有关。成功构建稳定过表达/敲减COX-2 的MDA-MB-231 细胞株。过表达COX-2 促进MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭（均P<0.01）,同时显著提高MMP2、MMP1、N-cadherin 和vimentin 的表达（均P<0.01）,但对细胞增殖无明显影响;而沉默COX-2 则有相反的作用,且可促进细胞增殖（P<0.05）。结论：COX-2 在脑转移乳腺癌组织中高表达,其可能通过调控EMT过程促进乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭。     

紫甘薯花色苷通过circ_0003998/miR-145轴调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨紫甘薯花色苷(purple sweet potato anthocyanin,PSPA)是否通过circ_0003998/miR-145轴调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭.方法:选用乳腺癌MDA-MB-231细胞,将其分为对照组,200、400和800μg/ml PSPA组,pcDNA组、...     

shRNA靶向沉默CNTN1表达抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-468增殖及克隆形成能力

目的:探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默CNTN1基因表达对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖及克隆形成能力的影响。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测乳腺癌细胞株MCF7-ADR、MDA-MB-468、MCF7以及Hs578T中的CNTN1 mRNA和蛋白表达水平。采用LipofectamineTM2000 向MDA-MB-468细胞株转染成功构建的靶向沉默CNTN1表达的shRNA载体片段,并采用RT-PCR法和Western blot法进行鉴定。分别通过MTT法、流式细胞仪技术和平板克隆实验检测各组细胞增殖及克隆形成能力的改变。结果:CNTN1 mRNA和蛋白表达水平在MDA-MB-468中最高。沉默组MDA-MB-468细胞发生G1期阻滞,增殖能力明显降低(P＜0.05),克隆形成能力明显减弱(P＜0.05)。结论:CNTN1基因在乳腺癌MDA-MB-468细胞中高表达,沉默其表达可抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和克隆形成能力。     

TET1-CD对乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖和迁移的影响及其作用机制

[摘要] 目的：探讨TET1 催化结构域（TET1-CD）基因高表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖、迁移的影响及其可能的作用机制。方法：慢病毒感染建立高表达TET1-CD的MDA-MB-231 细胞系,用qPCR检测细胞中TET1-CD mRNA的表达,Transwell实验和细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,MTT 法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力,WB实验检测MDA-MB-231 细胞上皮间质转化（EMT）途径相关蛋白E-cadherin、Vimentin、MMP2 以及Wnt、Hedgehog(HH)通路相关蛋白的表达水平。结果：过表达TET1-CD提高乳腺癌MDA-MB-231 细胞TET1-CD的表达水平（P<0.01）,明显抑制MDA-MB-231 细胞的增殖和迁移能力（均P<0.01）。过表达TET1-CD 可使乳腺癌MDA-MB-231 细胞E-cadherin 表达上升,Vimentin、MMP2 表达下调（均P<0.05）;可使β-catenin、C-myc、CyclinD1、Gli1 蛋白表达水平降低（均P<0.05）。结论：过表达TET1-CD可能通过Wnt、HH信号通路抑制EMT途径进而抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖和迁移。     

Tspan29在乳腺癌组织中的表达及其对MCF-7和MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的影响

目的：检测4次穿膜蛋白29（tetraspanins-29,Tspan29）在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平,探讨敲低Tspan29对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化（epithelieal-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法：收 集2017年6月至2018年2月复旦大学附属肿瘤医院闵行分院手术切除的20例乳腺癌患者的癌组织和相应的癌旁组织标本,以及乳腺癌细胞系 MCF-7、MDA-MB-231 和人乳腺上皮细胞 MDA-kb2,用 qPCR 和 Western blotting 检测乳腺癌组织和细胞系中Tspan29 的表达水平。通过 siTspan29 对 MCF-7、MDA-MB-231 细胞中 Tspan29 进行干扰,用 qPCR 法检测转染细胞中 Tspan29mRNA 和蛋白的表达水平,PCR 芯片法检测 MCF-7 细胞中 EMT 相关基因的表达,用 CCK-8 法、Transwell 实验检测 MCF-7 和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果：乳腺癌组织中Tspan29 mRNA和蛋白的表达水平显著高于癌旁组织（均 P<0.01）,MCF-7和MDA-MB-231细胞中Tspan29 mRNA和蛋白的表达水平显著高于MDA-kb2细胞（均P<0.01）。siTspan29干扰后,MCF-7细胞中Tspan29 mRNA和蛋白的表达水平显著下降（均P<0.05）;MCF-7细胞中EMT相关基因中有2个基因显著上调, 有7个基因显著下调;MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降（均P<0.05）。结论：Tspan29在乳腺癌组织及细胞系中表达水平显著上调,敲低Tspan29对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有显著的抑制作用。     

RNA干扰对MDA-MB-231乳腺癌细胞株骨保护素基因表达的抑制作用

目的 构建针对骨保护素（OPG）基因的一个载体编码三条短发夹RNA（shRNA）的真核表达质粒,观察其对MDA—MB-231乳腺癌细胞株OPG表达的抑制作用。方法选择3个针对OPG基因的RNA干扰（RNAi）位点,分别设计合成3对编码相应shRNA的DNA单链,每对单链连接形成双链后分别与线性化载体pGenesil-1．1、pGenesil-1．2、pGenesil-1．3连接形成pGenesil-1．1-shRNAl、pGenesil-1．2-shRNA2、pGenesil-1．3-shRNA3,对以上重组载体反复酶切连接,构建成重组质pGenesil—1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3,酶切鉴定和测序无误后,将该质粒转染MDA—MB一231细胞,以G418加压筛选,对转染细胞行单克隆化,稳定转染细胞行RT—PCR和Westernblot检测,确定其对OPG基因表达抑制作用。统计分析采用单因素方差分析和SLD分析法。结果成功构建了pGenesil-1．1—1．2-1．3-shRNA1-shRNA2-shRNA3重组质粒;以该质粒稳定转染MDA—MB-231细胞后其OPGmRNA和蛋白表达均较对照差异有统计学意义（P〈0．05）,RNAi对OPGmRNA和蛋白的表达抑制率分别为91％和73％。结论本研究构建了针对OPG的一个载体编码3条shRNA的真核表达质粒,通过RNAi抑制了MDA—MB-231细胞OPG基因表达,为进一步深入探讨肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用提供了相关实验基础。     

塞来昔布对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移、侵袭及黏附性的影响

背景与目的:三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)由于其高侵袭和高转移特性,是目前乳腺癌中预后最差的一种亚型.大量研究表明塞来昔布(celecoxib)具有很好的抗肿瘤活性,可以抑制肿瘤生长、减少肿瘤血管发生,防止肿瘤的早期转移.为了进一步明确塞来昔布与TNBC细胞侵袭活性之间的关系,本实验研究塞来昔布作用下人TNBC细胞MDA-MB-231黏附、迁移及体外侵袭能力的变化,并初步探讨其可能的机制.方法:以不同浓度的塞来昔布(0、40、80、120 μmol/L)作用MDA-MB-231细胞24 h后,采用细胞基质黏附实验检测塞来昔布对MDA-MB-231细胞黏附能力的影响;采用细胞划痕实验检测塞来昔布对MDA-MB-231细胞平面迁移能力的影响;采用Transwell侵袭小室实验检测塞来昔布对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响;RT-PCR检测塞来昔布作用前后基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)MMP-2和MMP-9 mRNA的表达情况.结果:经80、120 μmol/L塞来昔布作用24 h后,MDA-MB-231细胞与基质的黏附能力分别为(50.2±7.3)%和(31.5±2.2)%,与对照组(96.8±10.9)%相比显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05).Transwell侵袭小室实验结果显示,经80、120 μmol/L塞来昔布作用后MDA-MB-231细胞趋化运动明显减少,穿过人工基底膜的细胞较对照组显著降低(P<0.05).划痕实验结果显示,经塞来昔布作用后MDA-MB-231细胞平面迁移到损伤区的细胞数明显减少(P<0.05).RT-PCR结果显示,经塞来昔布作用MDA-MB-231细胞后,MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05).结论:塞来昔布能显著地抑制MDA-MB-231细胞黏附、细胞体外的迁移和侵袭能力,该作用可能与抑制MMP-2和MMP-9 mRNA的表达有关.