人表皮生长因子受体2过表达乳腺癌耐药后的治疗策略

人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）过表达是乳腺癌患者的一个独立预后因子。曲妥珠单抗单药治疗Her-2阳性转移性乳腺癌具有一定疗效。但由于一些生长因子（如EGFR、IGF1-R）转导作用增强,以及曲妥珠单抗与Her-2的亲和力下降,一些患者会对曲妥珠单抗的抗Her-2治疗产生原发性耐药或获得性耐药。研究显示,HER-2阳性乳腺癌患者即使在曲妥珠单抗治疗进展后,继续使用曲妥珠单抗,并与化疗药物联合或更换靶向药物或采用双靶向治疗,仍可以进一步改善预后。     

曲妥珠单抗联合放疗对HER2高表达胃癌细胞的协同杀伤作用

目的:研究曲妥珠单抗联合放疗对人类表皮生长因子受体2（HER2）高表达胃癌细胞NCI-N87的协同杀伤作用。方法:应用细胞增殖与毒性检测（CCK-8）法筛选曲妥珠单抗杀伤胃癌细胞的IC20浓度;将NCI-N87分为对照组与加药组,两组依次给予照射剂量不同的X线（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）,应用克隆形成实验分析两者的杀伤作用;凋亡实验分4组:对照、曲妥珠单抗、2 Gy照射、2 Gy照射+曲妥珠单抗,流式细胞仪用于测定凋亡率。结果:IC20为10 μg/ml。与单纯放疗相比,曲妥珠单抗与放疗同时作用可明显降低细胞存活率,差异具有统计学意义（P＜0.05）。凋亡率为对照（3.80±0.26）%、曲妥珠单抗（4.84±0.14）%、2 Gy照射（6.83±0.17）%、联合组（13.60±0.35）%,曲妥珠单抗或照射组均可增加NCI-N87细胞凋亡率,其中凋亡率在联合组中最高（P＜0.05）。结论:曲妥珠单抗和放疗可协同杀伤HER2高表达的胃癌细胞。     

曲妥珠单抗在HER-2阳性乳腺癌患者新辅助治疗中的应用研究进展

曲妥珠单抗是人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）的特异性抑制剂,在HER-2阳性乳腺癌患者新辅助治疗中的应用日益广泛。大规模的随机、对照临床试验证实,新辅助化疗联合曲妥珠单抗与单纯化疗比较能显著提高病理完全缓解（pathologic complete response,pCR）率。在曲妥珠单抗联合化疗的基础上加用拉帕替尼较单用曲妥珠单抗可大大提高pCR率。蒽环与非蒽环类化疗药物均可作为曲妥珠单抗的联合用药,内分泌治疗也可作为雌激素受体阳性患者的联合用药。pCR是曲妥珠单抗新辅助治疗后生存获益的独立预后因素,HER-2转阴而未达到pCR的患者为不良预后因素。本文将对曲妥珠单抗在HER-2阳性乳腺癌患者新辅助治疗中的研究进展进行综述。      

随机十二肽噬菌体展示文库筛选血型B抗原模拟多肽的实验研究

目的:筛选出替代血型B抗原的模拟多肽,用多肽抗原替代糖类抗原.方法:抗血型B抗原的单克隆抗体作为固相筛选靶分子,对随机十二肽噬菌体展示文库进行生物淘选(bio-panning),经包被-结合-洗脱-扩增等循环3轮,对筛选的克隆ELISA鉴定,并通过剂量依赖实验验证其结合特异性.最后提取DNA测序,确定模拟肽氨基酸序列.结果:3轮筛选结束,得到2个亲和力较强的十二肽序列TKNMLSL-PVGPG和HSLKHTQMSYSS.结论:经过生物筛选得到模拟多肽序列,利用噬菌体展示技术筛选糖类抗原的模拟肽具有可行性,为糖类抗原的研究提供一种新思路.     

Her-2阳性转移性乳腺癌的生物靶向治疗

目的:回顾性分析本院2010年至2012年Her-2阳性转移性乳腺癌患者的治疗经验,评价在曲妥珠单抗联合紫杉醇治疗的基础上联合与不联合帕妥珠单抗的疗效。方法:设定一定的入选及排除标准,筛选出符合要求的病例进行分析。采用曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合紫杉醇治疗的患者为观察组（54例）,曲妥珠单抗+紫杉醇治疗的患者为对照组（71例）,比较2种治疗方法的疗效。结果:相比于曲妥珠单抗+紫杉醇,曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合紫杉醇治疗在肿瘤缓解率及肿瘤无进展生存期方面具有明显优势,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合紫杉醇治疗Her-2阳性转移性乳腺癌疗效更好,值得临床推广。     

基于免疫微环境特征的曲妥珠单抗与免疫治疗联合应用预测模型

背景与目的：人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌患者的肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment,TIME）与曲妥珠单抗治疗效果显著相关，提示免疫检查点疗法联合曲妥珠单抗治疗的临床潜力。本研究旨在探索HER2阳性乳腺癌联合治疗的预测因子，筛选联合治疗的潜在获益人群。方法：纳入高通量基因表达（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库中509例接受曲妥珠单抗治疗的HER2阳性乳腺癌患者和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中67例HER2阳性乳腺癌患者的转录组与基因组数据，筛选曲妥珠单抗耐药组的差异表达基因进行功能富集分析、蛋白质互作网络构建。结合临床信息通过对数秩检验和多因素COX比例风险回归模型构建预测模型。并利用CIBERSORT反卷积法分析TIME特征，通过肿瘤免疫功能障碍和排斥（tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）评分预测免疫治疗获益。结果：通过...     

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4 ℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1 000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。     

曲妥珠单抗治疗失败的终末期胃癌应用吡咯替尼有效1例北大核心

胃癌是全球第五大常见肿瘤[1]。15%~20%的胃癌患者可以检测到人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性[2-4],初治的此类患者在化疗的基础上加入曲妥珠单抗可显著提高中位生存期(16个月vs 11.8个月)[5]。曲妥珠单抗因此作为HER2阳性晚期胃癌的标准一线靶向药物。但在曲妥珠单抗耐药后,换用其它的HER2抑制剂(包括曲妥珠单抗-美坦新偶联物、拉帕替尼、帕妥珠单抗等在内)是否仍然有效尚有不同看法[6]。     

阿司匹林联合曲妥珠单抗对HER-2阳性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响#br# #br#

目的 探讨阿司匹林联合曲妥珠单抗对表皮生长因子受体2（HER 2）阳性乳腺癌SKBR 3细胞增殖和凋亡的影响。方法 将SKBR 3细胞分为对照组、阿司匹林组（5 mmol／L）、曲妥珠单抗组（30 μg／ml）和联合组（5 mmol／L 阿司匹林+30 μg／ml 曲妥珠单抗）,采用MTT法、流式细胞术分别观察不同药物处理对SKBR-3细胞增殖和凋亡的影响。结果 阿司匹林组SKBR 3细胞增殖率为（79.6±2.61）％,曲妥珠单抗组为（48.2±3.35）％,联合组为（21.5±1.66）％,组间差异有统计学意义（P＜0.05）。阿司匹林、曲妥珠单抗联合作用指数（CI）为1.0,属于叠加作用。阿司匹林组SKBR 3细胞凋亡率为（273±347）％,曲妥珠单抗组为（35.3±2.80）％,联合组为（56.2±3.95）％,组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 阿司匹林联合曲妥珠单抗能有效抑制HER-2阳性乳腺癌细胞的增殖,两药联合有可能成为HER 2阳性乳腺癌的临床治疗新模式。     

筛选与KDR有结合活性的小肽

目的：从噬菌体12肽库和环7肽库中,筛选能够与KDR分子有特异结合活性的小肽。方法：以KDR/IgGFc为靶分子筛选噬菌体12和肽7肽库,经过3轮筛选和竞争性洗脱后,由ELISA、细胞-ELISA和竞争结合实验,鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：从40个噬菌体克隆中得到12个能特异性与靶分子结合的阳性克隆,其中,6个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合力,6个结合力较弱。结论：测序结果表明,12条小肽的一级结构中没有发现共同模式。特异性与KDR结合的活性小肽,有望在临床上作为放化疗药物的导向肽,以提高药物的选择性和降低其毒副作用。     

噬菌体随机12肽库筛选肝癌患者血清肿瘤标记物的初步研究

目的：从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与肝癌患者血清特异性结合的短肽分子.方法：采用肝癌患者血清作为配基,筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表达的随机12肽文库.按吸附一洗脱一扩增的淘筛过程,经3轮淘筛后,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,评价分析其诊断肝癌的价值.结果：经3轮淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近100倍.用.ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的单个噬菌体克隆,其中特异性最好的3个克隆具有诊断肝癌的潜在价值.结论：噬菌体展示肽库技术,可以有效进行肝癌相关抗原肽的筛选研究,为获得特异性诊断试剂进而为肝癌的诊断提供依据.     

MDA-MB-231乳腺癌细胞特异性多肽的初步筛选

目的 利用噬菌体展示技术,从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞的噬菌体克隆.方法 以人正常乳腺细胞为减性筛选细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行筛选,挑取富集后的阳性单克隆噬菌体,酶联免疫吸附试验（ELISA）及DAB染色鉴定阳性噬菌体的特异性及亲和力.结果 经过3轮筛选,噬菌体得到约113倍的富集,随机挑选11株单克隆噬菌体,ELISA显示8号噬菌体单克隆对乳腺癌细胞的亲和力是对照的6.5倍,DAB鉴定亦显示其对乳腺癌细胞的特异性及亲和力最高,命名为LK-8.结论 利用噬菌体筛选技术成功筛选出能够特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞的特异性噬菌体单克隆LK-8,可为进一步合成特异性多肽用于早期诊断和靶向治疗乳腺癌奠定基础.     

Screening peptides binding specifically to colorectal cancer cells from a phage random peptide library

The aim of this study was to screen for polypeptides binding specifically to LoVo human colorectal cancer cells using a phage-displayed peptide library as a targeting vector for colorectal cancer therapy. Human normal colorectal mucous epithelial cells were applied as absorber cells for subtraction biopanning with a c7c phage display peptide library. Positive phage clones were identified by enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence detection; amino acid sequences were deduced by DNA sequencing. After 3 rounds of screening, 5 of 20 phage clones screened positive, showing specific binding to LoVo cells and a conserved RPM motif. Specific peptides against colorectal cancer cells could be obtained from a phage display peptide library and may be used as potential vectors for targeting therapy for colorectal cancer.     

应用随机多肽文库分析BAC5单抗相关的抗原表位

目的　鉴定能被BAC5单抗识别的定位于鼻咽癌细胞表面的抗原表位。方法　应用BAC5单抗作为靶抗体对噬菌体呈现的随机 12肽文库进行 3轮生物淘洗 ,用抗体捕获和竞争试验的夹心ELISA方法选择和鉴定阳性噬菌体克隆 ,对阳性和阴性噬菌体的外源性DNA片段进行序列分析 ,推导和比较由这些噬菌体所呈现的多肽氨基酸序列。结果　通过 3轮生物淘洗能被抗体捕获的噬菌体克隆为 77% ( 35 /45 )。用竞争试验从所捕获的克隆中测得 8个阳性克隆。来自这 8个克隆的噬菌体呈现三种外源多肽 ,即$CH Q S H Y P Y P V V S L ( 4/8)$CQ N Q A W F S Q P P V R M ( 3/8)和 T Q A Y K G F P V L P S ( 1/8) ,与来自阴性克隆的多肽序列 N H Q S T F W Q K W T A ( 6 /6 )比较 ,前 3个序列在靠近肽的N端都具有相同的脯氨酸 (P)和缬氨酸 (V)结构 ( P V )。结论　BAC5单抗能识别近N端含有脯氨酸和缬氨酸结构的多肽。这些多肽可能模拟存在于鼻咽癌细胞表面并与BAC5单抗相关的抗原表位的构象。     

胃癌细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 筛选与胃癌细胞特异性结合的多肽。方法 以正常细胞为吸附细胞,胃癌细胞为筛选靶细胞对噬菌体随机12肽库进行消减筛,用细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞和组织化学法及裸鼠正常组织结合实验鉴定阳性克隆并进行DNA测序。结果 经三轮筛选,利用ELISA从随机挑选的24个噬菌体克隆中得到8个与胃癌细胞具有高结合力的噬菌体阳性克隆,经免疫细胞化学及裸鼠正常组织结合试验鉴定,发现第20、24两个克隆能与胃癌细胞特异性结合,而不与正常细胞和裸鼠组织结合,噬菌体阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论 得到两个序列不同的特异性结合胃癌细胞的噬菌体克隆,这可为进一步的研究提供实验依据。     

体内噬菌体展示技术筛选人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽及其性质、结合效果研究

目的探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果,为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型,采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序,选取重复率高的序列合成多肽,制备光学分子探针,应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示,随筛选轮次增加,肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加;肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织(肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏),肿瘤组织切片扫描图像的吸光度(A)值均较正常组织高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。ELISA结果显示,随机选取的50个单克隆噬菌体中,22个为阳性(亲合力≥2)。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后,得到4条有重复的氨基酸序列,选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC,化学合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。结论利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC,有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。     

环7肽库筛选胃癌耐药细胞特异性结合短肽

目的获得与胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR特异结合的抑制耐药短肽,作为提高胃癌化疗效果的先导化合物。方法以SGC7901/VCR细胞为靶细胞,胃粘膜永生化上皮细胞GES,胃癌药敏细胞SGC7901为吸附细胞对噬菌体7肽库进行消减筛选,用细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序,利用竞争抑制试验确定阳性克隆的结合部位是否为外源性肽段。结果经4轮筛选,从随机挑选的30个噬菌体克隆中得到14个能特异性与SGC7901/VCR结合而不与胃癌药敏细胞结合的阳性克隆,确定其氨基酸序列分别为SY1和SY2(筛选所得安基酸序列正在专利申请中),含SY1为阳性克隆。结论用噬菌体环7肽库成功筛选到能特异性结合胃癌耐药细胞株的短肽,为肿瘤治疗或药物靶向治疗奠定基础。     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

Analysis of BAC<Subscript>5</Subscript> mcAb-related epitope using random peptide library

Objective To identify epitope relating to BAC₅ mcAb, a kind of monoclonal antibody (mcAb) located on the surface of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Methods Using BAC₅ mcAb as a selected target, the 3 rounds of biopanning to a 12 mer random peptide library (RPL) presented by M13 phages were carried out. The positive M13 phage clones were chosen and confirmed with sandwich ELISA for antibody capture and competitive assay. The exogenous DNA fragments in the positive/negative M13 phages were sequenced to deduce and compare the order of the amino acids of exogenous peptides among the phage clones. Results 77% (35/45) of the phages eluted from the 3rd round of biopnning could be captured by BAC₅ mcAb. The 3 kinds of the peptides were displayed by M13 phages from the 8 positive clones identified with competitive assay. The same character of “-P-V-” structure existed near N-terminus of the 3 different peptides, i. e.-H-Q-S-H-Y-P-Y-P-V-V-S-L- (4/8)-Q-N-Q-A-W-F-S-Q-P-V-R-M-(3/8) and T-Q-A-Y-K-G-F-P-V-L-P-S- (1/8) in comparison with the peptide “-N-H-Q-S-T-F-W-Q-K-W-T-A-” displayed by M13 phages from the negative clones (6/6). Conclusion BAC₅ mcAb can recognize the 3 kinds of the peptides with-P-V-structure near N-terminus. These peptides mimic the structure of the epitope on the surface of NPC cells recognized by BAC₅ mcAb. This project was founded by Health Foundation of Guangdong Province (Grant No. A1999212)     

In Vivo Selection of Phage Sequences and Characterization of Peptide-specific Binding to Breast Cancer Cells

OBJECTIVE To screen specific polypeptide target binding to breast cancer xenogra s in vivo from a phage-displayed peptide library in order to provide peptide sequences for breast cancer tumor-targeting diagnosis and therapy. METHODS A mouse model for carrying breast cancer xenografts was established using Tientsin Albinao II mice(TA II).A 12-peptide library was biopanned through 4 rounds. Phages were recovered and titrated from tumor xenografts and control tissue(liver).The distribution of phages was detected by immunohistochemical staining. RESULTS Phage homing to breast cancer was enriched through 4 rounds of biopanning,being 14-fold of that recovered from liver tissue.A peptide sequence,ASANPFPTKALL was characterized by randomly picked-up clones which appeared most frequently. Immunohistochemical staining revealed phage localization in cancer xenografts 40 min after injection of the enriched phages. When a specific phage was tested individually,the phage reclaimed from breast cancer xenografts was 14 times as those from control tissues. CONCLUSION Tumor-specific homing peptides may provide an effective tool for breast cancer target therapy.The in vivo phage display selection technique employed in this study was feasible and applicable to screening peptides that home to breast cells.