发育中的海马神经元离子通道功能变化

目的 研究发育中的海马神经元电压依赖性钠、钾、钙离子通道（DCCs）及N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体通道电流幅度的变化。方法 应用膜片钳技术分别对培养日龄为6、16d海马神经元电压依赖性钠、钾、钙离子通道及NMDA受体通道电流进行全细胞记录，研究其离子通道电流幅度变化。结果 与培养日龄为6d海马神经元相比，培养日龄为16d海马神经元电压依赖性钠离子通道电流最大幅值无显著差异；其电压依赖性钾离子通道电流最大幅值显著增加（P〈0．05）；其VDCCs最大幅值亦显著增加（P〈0．001）；其NMDA受体通道电流最大幅值显著增加（P〈0．05）。结论 随着海马神经元发育，其电压依赖性钾、钙离子通道及NMDA受体通道功能更趋成熟，其电压依赖性钠离子通道功能则无显著变化。     

母体IgG对NMDA诱导的其幼鼠海马神经元损伤的保护作用的研究

目的研究母体免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）对N甲基D天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱导的其幼鼠海马神经元损伤的作用及机制。方法通过体外幼鼠海马神经元原代培养,观察海马神经元在NMDA神经毒性作用下的变化,以及给予不同浓度的母体IgG后的影响。通过测定神经元漏出的乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）活力,观察神经元损伤情况,用锥虫蓝染色观察细胞死亡率。结果体外神经毒性损伤后,培养神经元漏出的LDH较NMDA处理前和正常对照组高（P〈0．01）;给予不同浓度的母体IgG（分别为10mg／L、100mg／L）后,LDH漏出较NMDA组低（均P〈0．01）,而且较大剂量比小剂量的保护作用更为显著（P〈0．05）。锥虫蓝染色显示NMDA组神经元死亡率较NMDA处理前和正常对照组高（P〈0．01）;给予不同浓度的母体IgG（分别为10mg／L、100mg／L）,死亡率均比NMDA组低（P〈0．05、0．01）,而且较大剂量比小剂量的保护作用更强（P〈0．05）。结论体外幼鼠海马神经元原代培养结果表明,50μmol／L NMDA可诱导幼鼠海马神经元损伤,母体IgG对NMDA的神经毒性有保护性作用,而且有剂量依赖关系。     

缺氧缺血性脑病新生大鼠发育期间海马神经元的变化与康复

目的 探讨缺氧缺血性脑病新生大鼠发育期间海马神经元的变化与康复之间的关系。方法 采用7日龄Wistar仔鼠，实验组制作缺氧缺血性脑病模型。采用形态学和形态计量学、突触体素免疫组织化学及学习记忆能力测试的方法，对生后7d到2个月，分8个时段对海马CA1区细胞形态及免疫反应阳性物质进行动态观察，对4周和2个月仔鼠进行学习记忆能力测试。结果 随增龄对照组大鼠CA1区神经元数量有所减少，但突触体素阳性反应物吸光度值相对升高。实验组CA1区细胞质量明显降低，伴学习记忆能力降低，但与上一实验组比较，随增龄突触体素阳性反应物吸光度值升高（7d与72h比较t=2．012，P〈0．05；2周与7d比较t=2．014，P〈0．05；3周与2周比较，t=2．716，P〈0．01；4周与3周比较，t=2．011，P〈0．05）。结论 海马区细胞减少、轴突溃变、突触损失是神经功能障碍的病理基础。早期干预可提高神经元的质量，促进神经系统功能发育。     

缺氧缺血再灌注新生鼠磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白、神经生长因子对神经元的保护作用

目的探讨神经元的抗凋亡保护机制，评价环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）、神经生长因子（NGF）对神经元损伤后的保护作用。方法7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血性脑损伤（HIBD）未治疗组、小干扰RNA（siRNA）治疗组、siRNA加NGF治疗组。按照改良的Rice法制备HIBD再灌注模型，各治疗组于再灌注后开始予1次siRNA干预治疗（10mg／kg）；siRNA加NGF组予NGF（15μg／kg），1次／d。于治疗的不同时间通过免疫组织化学和Western blot法检测磷酸化的CREB、NGF在仔鼠HIBD再灌注后海马、丘脑神经元的表达变化。通过Thionine染色检测神经元凋亡。结果HIBD未治疗组3h仔鼠右侧海马CA1区磷酸化的CREB（p-CREB）表达达高峰，7d后降至假手术对照水平。3hNGF表达开始增加，12h持续达高峰，7d后仍明显高于假手术组（P〈0．05）。siRNA治疗组p-CREB与NGF表达随时间逐渐下降。HIBD再灌注未治疗组24h右侧海马CA1区已有明显的凋亡，7d神经元凋亡与假手术组相比无统计意义。siRNA治疗组神经元有大量的丢失；而siRNA加NGF治疗组神经元与假手术组比较无明显丢失。结论CREB经信号转导调节大鼠NGF的表达，从而促进其神经元损伤后修复，减少神经元死亡。     

氯氨酮对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究

氯氨酮是一种非竞争性N甲基D天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂,它能通过血脑屏障与NMDA型受体离子通道结合,阻断钙离子通道,在临床上是一种常用的诱导麻醉剂。竞争性或非竞争性NMDA型受体阻断剂能减轻缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)所诱导的脑损伤。离体实验显示,氯氨酮对新生动物缺氧缺血性神经元损伤具有保护作用。2002年7月～2003年5月,我们对7日龄新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(1iypoxic-ischemic brain damage,HIBD)的动物模型腹腔注射氯氨酮,观察其在HIBD后的神经保护作用,报告如下。     

神经生长因子对新生鼠缺氧缺血性脑损伤神经修复作用的研究

目的研究神经生长因子（NGF）对新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后，神经干细胞巢蛋白（nestin）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，探讨其神经修复作用机制。方法7日龄新生SD大鼠84只，建立HIBD模型后，随机分为假手术组、缺氧缺血组及NGF干预组各28只。神经生长因子干预组腹腔内注射NGF（6000U／kgJd），缺氧缺血组同步注射等量生理盐水。采用免疫组化法检测NGF对新生大鼠HIBD后不同时间内Nestin及VEGF表达的影响。结果缺氧缺血性脑损伤后12、24h，3、7、14d，NGF干预组在大脑皮质、海马和室旁区的Nestin表达高于缺氧缺血组（P〈0．05），且高峰提前到3d。HIBD后即刻、3、12、24h及3d，NGF干预组在大脑皮质、海马区VEGF的表达高于缺氧缺血组（P〈0．05），且高峰提前到3h。结论NGF对HIBD具有神经修复作用可能是通过上调nestin及VEGF的表达而实现的。     

三磷酸腺苷与神经生长因子对缺氧复氧后大鼠皮质神经元细胞活性及凋亡的影响

目的探讨体外三磷酸腺苷（ATP）、神经生长因子（NGF）对缺氧复氧大鼠皮质神经元的保护作用。方法取体外培养8d的Wistar大鼠皮质神经元，随机分为正常对照组、缺氧组、ATP组和NGF组。用噻唑盐比色法（MTF）、乳酸脱氢酶（LDH）法测定细胞活性变化，流式细胞仪术、透射电镜检测细胞凋亡率和凋亡。结果与对照组比较，缺氧组神经元细胞活性明显降低，细胞凋亡率显著增加；ATP和NGF能明显改善缺氧对神经元细胞活性的影响，细胞凋亡率降低（P〈0．05）；与NGF组比较，ATP组神经元细胞活性增高，细胞凋亡率降低（P〈0．05）。结论缺氧能够造成大鼠大脑皮质神经元的损伤并诱导其凋亡，ATP及NGF对缺氧．复氧后大脑皮质神经元有保护作用。     

骨髓间充质干细胞条件培养基对缺氧大鼠神经元凋亡的影响

目的观察大鼠骨髓间充质于细胞（BMMSCs）条件培养基（B—CM））对缺氧大鼠大脑皮质神经元凋亡的影响。方法分离、培养、传代Wistar大鼠BMMSCs，细胞融合达90％时更换培养基，继续培养24h后收集培养上清液即B—CM；取培养8d的新生Wistar大鼠大脑皮质神经元，分正常对照组、缺氧组、B—CM组，分别于缺氧0、6h、复氧24h用四甲基偶氮唑盐微量反应比色（MTT）法检测各组细胞活性，用流式细胞仪和透射电镜技术检测神经元凋亡情况。结果神经元缺氧6h细胞活性较对照组明显降低，复氧24h后细胞凋亡率明显升高（P〈0．01）。B—CM培养后细胞活性和缺氧前无差异，细胞凋亡明显较少（P〈0．01）。结论B—CM对缺氧一复氧引起的神经元凋亡有明显的防护作用。     

缺氧缺血后新生大鼠海马组织CA1区脑源性促红细胞生成素的表达

目的观察缺氧缺血（HI）后新生大鼠海马CA1区脑源性促红细胞生成素（EPO）的表达,探讨HI后新生大鼠内源性因素激发海马神经发生上调的可能机制。方法选用144只7日龄SD大鼠,随机分为4组：正常对照组（C组）、单纯缺氧组（H组）、单纯缺血组（I组）、缺氧缺血组（HI组）,每组又分为1h、6h、16h、1d、3d和7d共6个时间点。分别对其行HE染色和EPO免疫组织化学法CA1区脑源性EPO表达。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果C组各时间点CA1区EPO表达无明显差异（F=1.185P〉0.1）,其余各组各时间点差异显著[F（H组）=33.57,F（I组）=133.6,F（HI组）=69.75Pa〈0.001];HI后16h,海马CA1区脑源性EPO表达达到较高水平,与该组总体比较差异显著（t=13.08P〈0.001）,以后随时间延长逐渐下调;H组、I组、HI组与C组比较差异均有显著意义（q=32.06,23.84,47.12Pa〈0.001）。结论脑源性EPO表达在新生大鼠HI后增加,受低氧影响最明显;EPO表达高峰在缺氧早期,推测低氧、EPO早期高表达可能是参与海马神经发生的内源性因素之一。     

参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡影响

目的研究参附注射液对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠海马神经元凋亡的影响。方法实验分成两部分：1.流式细胞术检测缺氧缺血（HI）前2 h、HI后2、12、24 h,3、7、14和28 d各时间点新生大鼠海马CA1区神经元凋亡率;2.免疫组织化学测HI前2 h、HI后2、12、24 h,3、7、14和28 d各时间点新生大鼠海马CA1区神经元Bcl-2、Bax蛋白表达。建立新生大鼠HIBD模型。每组实验随机分为4组：假手术组（S）,9 g/L盐水对照组（C）,参附预处理组（P）,参附治疗组（SF）。结果SF和P组海马神经元凋亡情况明显低于C组（P〈0.01,〈0.05）,且Bcl-2表达显著增多（P〈0.05,〈0.01）,而Bax表达明显下调（P〈0.05,〈0.01）。结论参附注射液可明显上调新生大鼠HIBD后海马神经元Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少HIBD新生大鼠海马神经元凋亡发生。     

慢性低氧对大鼠血浆腺苷水平的影响

目的研究慢性低氧时大鼠血浆腺苷水平的变化及其机制。方法将42只雄性SD大鼠随机分成常氧组(对照组),低氧1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d组(H1、H3、H5、H7、H14、H21组),每组6只。分别于低氧第1天、第3天、第5天、第7天、第14天及第21天测定各组大鼠血浆腺苷水平、腺苷脱氨酶(ADA)活性以及血浆中5’-核苷酸酶(5’-NT)水平。应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果低氧1 d后大鼠血浆腺苷水平开始升高,于第3天达到最高峰,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001);此后,随着低氧时间的延长,血浆腺苷水平逐渐下降,第14天及第21天与对照组比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。血浆5’-NT水平在低氧第3天增高最显著(P<0.001),在低氧3 d后逐渐下降,但仍高于对照组(P<0.001)。血浆ADA活性在慢性低氧第1天、第3天较对照组明显增高(Pa<0.001),随着低氧时间的延长,其活性稍下降,但仍明显高于对照组(P<0.001)。结论慢性低氧在早期可引起血浆腺苷水平增加,后期血浆腺苷水平逐渐降低,其变化与5’-NT水平和ADA活性有关。     

发育中神经元惊厥性损伤的相关基因表达

目的　研究惊厥发生后不同发育阶段神经元白细胞介素 1受体 (IL 1R)、Cx36基因表达。方法　无镁细胞外液短暂处理培养的发育中皮层神经元 ,用Real time定量RT PCR方法检测IL 1R、Cx36mRNA表达改变。结果　 1.体外培养 6、17d神经元无镁处理后IL 1R表达呈一过性降低 ,之后 6d神经元表达恢复正常 ,而17d神经元表达增加 ,于处理后 2 4h达高峰 (P <0 .0 5 )。 2 .体外 6d的神经元无镁处理后Cx36表达渐增高 ,于处理后 2 4h达高峰。体外 17d神经元处理后 6hCx36表达与对照组比较明显降低 (P <0 .0 5 ) ,2 4h降低达峰值。结论　无镁诱导惊厥后体外 6、17d神经元IL 1R、Cx36表达不同 ,可能与惊厥造成 6、17d的神经元损伤不同有关     

低氧致肺动脉高压新生大鼠TRIP6和cyclinD1表达及其对肺血管重塑的影响

目的：研究低氧致新生鼠缺氧性肺动脉高压( hypoxia induced pulmonary hypertension, HPH)发生发展过程中,肺组织中TRIP6、cyclinD1蛋白动态变化,及其对肺血管重塑的影响。方法采用低氧方法(FiO20.10~0.12)制备新生SD大鼠HPH模型,对照组予正常氧浓度FiO20.21。每组32只于实验后14 d,监测右心室平均压力,采集心脏及肺组织标本,分别用BL420系统监测右心室压力,测定右心室肥厚指数及肺小动脉中膜面积百分比、肺小动脉中膜厚度百分比评估模型是否成功。同时每组大鼠分别于实验后3、7、10、14 d,采集肺组织标本,采用免疫组织化学及Western blot技术观察TRIP6和cyclinD1蛋白表达变化。结果与对照组比较,模型组14 d后,肺小动脉管壁增厚,管腔变狭窄,肺小动脉中膜面积百分比[(42.28±1.64)％ vs.(24.12±0.83)％]、中膜厚度百分比[(28.26±1.41)％vs.(16.94±0.90)％]、右心室肥厚指数(0.52±0.02 vs.0.29±0.01)、右心室平均压力[(22.00±0.82)mmHg vs.(12.10±0.48)mmHg,1 mmHg＝0.133 kPa]均显著增加(P<0.01);TRIP6在对照组14 d时肺小动脉管壁几乎无表达,模型组明显增强,其表达水平在3、7、10、14 d时明显增高( P<0.05);cyclinD1蛋白表达水平在3 d时两组比较差异无统计学意义( P>0.05),7、10、14 d时明显高于对照组(P<0.05);Pearson相关分析显示,14 d时肺组织TRIP6蛋白与cyclinD1蛋白表达呈明显正相关(r＝0.587,P<0.05),中膜厚度百分比、中膜面积百分比与肺组织TRIP6蛋白、cyclinD1蛋白表达均呈明显正相关(r＝0.878,P<0.01;r＝0.812,P<0.01;r＝0.872,P<0.01;r＝0.789,P<0.01)。结论在HPH发生中,肺组织中TRIP6蛋白和cyclinD1表达上调,并且增加的TRIP6和cyclinD1蛋白表达可能与肺血管重塑相关,进而影响肺动脉高压的发生发展过程。     

新生大鼠大脑皮质神经元的原代培养及其鉴定

目的 建立新生大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法 ,以获取数量多、纯度高的神经元.方法 取出生1d内的SD大鼠的大脑皮质,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,计数后种植于6孔板培养,培养24h后用终浓度10μmol·L-1的阿糖胞苷处理.采用倒置相差显微镜每天观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl's染色进行神经元的鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养神经元的纯度.结果 培养2h后,大部分细胞已贴壁,细胞圆且立体感较强;接种24h后,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈圆形或椭圆形;培养4d后,细胞突起伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状;培养6～8d细胞状态最佳,细胞胞体饱满,光晕明显,形成完整神经网络;培养14d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染色后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果 显示,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论 本研究获得皮质神经元的方法 简单经济,通过形态学观察、Nissl's染色及免疫荧光染色可以对体外培养的皮质神经元细胞进行准确鉴定.     

脑源性神经生长因子经自噬对胚鼠神经元缺氧损伤的保护作用

目的 探讨脑源性神经生长因子(BDNF)对胚鼠缺氧神经元是否有保护作用及其机制是否与激活自噬有关.方法 将SD大鼠胚鼠(孕17 ～ 19 d)的大脑皮质神经元在体外进行原代细胞培养,并进行神经元鉴定.培养7～10d,选取生长良好的神经元用于前后两部分实验.1.第一部分随机分为3组,对照组:不加入药物,只作缺氧处理;3-甲基腺嘌呤组(3-MA组):提前加入不同浓度的3-MA后作缺氧处理,依次为5 mmol·L-1 3-MA组、10 mmol·L-1 3-MA组、20 mmol·L-1 3-MA组;BDNF组:提前加入不同浓度的BDNF后作缺氧处理,依次为50μg· L-1 BDNF组、100 μg·L-1 BDNF组、200 μg·L-1 BDNF组.观察不同剂量3- MA、BDNF对缺氧神经元损伤的作用.之后以细胞计数盒-8(CCK-8)测定各组细胞活力,确定干预缺氧神经元的最佳药物浓度.2.第二部分分为3组,对照组:单纯缺氧,不加药物;100 μg·L-1 BDNF组:加入100 μg·L-1BDNF;10 mmol·L-1 3-MA组:加入10 mmol·L-1 3-MA.免疫蛋白印迹法检测3组缺氧神经元在不同缺氧时间点细胞自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,以LC3Ⅱ/actin的相对表达量判断自噬发生的程度.结果 1.免疫荧光鉴定:与未缺氧神经元比较,缺氧神经元突触回缩,细胞网状结构被破坏.2.神经元细胞活力:50 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力最强,100 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力其次(Pa＜0.05);随3-MA剂量加大,各剂量组神经元活力明显降低.3.免疫印迹:于缺氧1h、3h、5h,100 μg·L-1 BDNF组缺氧神经元的LC3表达量,均较对照组相应时间点明显上调(Pa＜0.05).结论 BDNF通过自噬途径对缺氧损伤神经元起保护作用.     

环境刺激对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠学习记忆及海马病理学的影响

目的研究环境刺激对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠学习记忆及海马病理学的影响。方法按Rice法制备7日龄SD大鼠HIBD模型。随机分为3组丰富环境(EE)组、贫瘠环境(IE)组和标准环境(SE)组。另设假手术(Sham)组。各组大鼠造模后d1开始分别予不同环境刺激,造模后d28,通过Morris水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力,HE染色观察其海马病理形态学变化,尼氏染色计数海马存活神经元数目。结果在学习记忆能力上,EE组成绩明显优于SE组(P<0.01)和IE组(P<0.001),与Sham组相比差异不明显(P>0.05);而SE组显著优于IE组(P<0.01)。HE染色见Sham组左侧海马无异常,EE组左侧海马轻度异常,SE和IE组左侧海马明显异常。神经元尼氏染色计数显示,EE组左侧海马神经元存活数目多于SE组(P<0.05)和IE组(P<0.01),与Sham组差异不明显(P>0.05),SE组显著低于Sham组(P<0.01),明显多于IE组(P<0.05)。结论EE有利于脑损伤修复,对HIBD新生大鼠具有脑保护作用;IE不利于脑损伤修复。     

缺氧缺血性脑病新生儿神经细胞凋亡及星形胶质细胞的变化

目的 探讨HIE患儿神经细胞凋亡与星形胶质细胞(AST)的变化.方法 HIE死亡新生儿25例.男14例,女11例.对25例HIE患儿脑病理标本进行大体观察、光镜观察,原位末端TUNEL法观察神经细胞凋亡,免疫组织化学观察胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)标记的AST水平的变化,分析其与HIE发生、病程的关系.采用方差分析和q检验进行分析.结果 HIE患儿25例大体标本均存在脑膜紧张,软脑膜血管充盈、淤血,脑回增宽变平,脑沟变窄.切面湿润,血管扩张,点状或小灶性出血.光镜观察脑标本均可见神经细胞凋亡,大脑以存活24 h～6 d神经细胞凋亡程度重(P<0.05),小脑以存活3 d内神经细胞凋亡程度重(P<0.05),延髓以存活24 h～3 d神经细胞凋亡程度最重(P<0.05);脑标本均可见AST增生,小脑AST表现为生后24 h内死亡者增生程度重(P<0.05),生存时间越长,增生程度反而越轻;慢性缺氧时大脑AST增生程度重(P<0.05),急性缺氧时延髓增生程度重(P<0.05),混合性缺氧大脑及延髓增生程度均较重(Pa<0.05).结论 HIE新生儿神经细胞凋亡及AST增生程度在不同脑区明显不同,且与HIE的发生及病程密切相关.