原发性高胆固醇血症家系成员载脂蛋白B-100基因突变的筛查

目的　筛查原发性高胆固醇血症患者载脂蛋白B 1 0 0基因可能存在的突变体。方法　通过改变参与巢式聚合酶链反应 (PCR)反应的一个寡核苷酸引入酶切入点法检测载脂蛋白B 1 0 0基因发生R350 0Q的突变情况。在其附近可能存在的突变位点用单链构象多态性分析 (SSCP)和DNA测序分析法进行筛查。结果　 34例样本均未发现载脂蛋白B 1 0 0基因突变位点。结论　载脂蛋白B 1 0 0基因突变可能不是引起原发性高胆固醇血症的主要原因。     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制的研究

目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B基因。结果　以 H3 7Rv标准株为对照 ,10 7株结核分枝杆菌临床分离株的 16 S r DNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准相同。 38株药物敏感株的 emb B基因、SSCP均泳动正常 ,RFL P和 DS分析与对照株相同。 6 9株耐乙胺丁醇 (EMB)分离株中 ,2 5株 (36 .2 % ) emb B基因 SSCP泳动异常 ;8株 RFL P分析异常 ;DS分析 2 5株均为 30 6位密码子突变 ,其中 1株合并有 2 74位 CGC→ CCC突变 ,其 EMB MICs均≥ 2 0 μg/ml;8株为 30 6位 ATG→ATA或 ATT突变 ,17株为 ATG→GTG或 CTG突变 ,后者 EMB MICs均≥ 30μg/ml。结论　部分结核分枝杆菌耐乙胺丁醇是由于其 emb B基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变所致 ,PCR- SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型的简便、快速的方法     

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

人类白血病P53基因异常的研究

以多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析31例不同类型的白血病P53抗癌基因点突变,16例急性粒细胞白血病中有1例,6例慢粒性细胞白血病中有1例发生 P53基因扩增片段泳动变位,提示 P53抑癌基因点突变导致功能失活,这与白血病的发病可能存在某种关系。     

46XY女性性反转综合征一例sry基因的错义突变分析

目的探讨46XY女性性反转综合征患者发病的分子机制。方法应用荧光原位杂交技术(FISH)、聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性内切酶分析、单链构象多态性分析及基因测序技术对1例46XY女性性反转综合征进行sry基因的错义突变分析。结果本例FISH证实为X、Y染色体结构,无嵌合体存在;PCR扩增出现609 bp特异性片段;限制性内切酶分析及单链构象多态性分析发现单链电泳带发生变异;且基因克隆测序分析证实HMG盒内第244位核苷酸位置存在点突变(A→T),造成第82位密码子由原来编码天冬酰胺Asn(AAT)变为编码酪氨酸Tyr(TAT),发生错义突变,以致出现女性表型。结论 sry基因在性别决定中起主导作用,对46XY女性患者应在sry基因检测的基础上寻找其他相关病因,以进一步了解其发生性反转的分子遗传学机制,为判断真实性别提供依据。     

核酸适配体在抗肿瘤药物主动靶向传递中的应用

核酸适配体是通过指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中筛选并富集的对某些靶点具有高特异性和高结合率的小分子DNA或RNA片段.核酸适配体具有直接抑制肿瘤细胞增殖的作用,通过结构修饰可增强在体内的稳定性.此外,它可与载药纳米结构键合,用于肿瘤诊断和治疗.本文综述了核酸适配体的肿瘤靶点、筛选方法及其在肿瘤诊断和治疗中的应用.     

Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子的初步研究

目的利用Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子。方法通过80mg/L氧化性低密度脂蛋白诱导THP-1巨噬细胞为泡沫细胞;聚合酶链反应扩增文库;生物素-链霉亲和素磁珠分离法构建单链DNA文库;以巨噬细胞源性泡沫细胞为靶细胞,巨噬细胞和血管平滑肌细胞为反筛细胞,利用Cell SELEX技术筛选与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的寡核苷酸序列,并对最后一轮筛选结果进行克隆测序。结果 PCR的退火温度对PCR产物的量有显著的影响,退火温度由65℃提高为72℃时的产物量明显增加。利用生物素-链霉亲和素磁珠分离法获得了纯度高、产量大的ssDNA文库;经过18轮筛选后,成功获得了28个与预期大小相同的ssDNA序列。结论利用Cell SELEX技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子,为研发用于动脉粥样硬化的早期无创诊断试剂和靶向治疗药物奠定了基础。     

反式二氢二醇环氧苯并芘诱发细胞P53基因的变化

目的　观察苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti 7,8, dihydrodiol 9,10 epoxidebenzo(a)pyrene ,BPDE]诱发的恶性转化的人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcells ,HBE)及其裸鼠成瘤细胞中的p5 3基因突变情况,探讨BPDE诱导细胞癌变的机制。方法　多聚酶链聚合反应 单链构象多态性分析(PCR SSCP)、基因测序。结果　PCR SSCP分析结果提示,反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞p5 3基因的Exon 7和Exon 8有突变。基因测序发现裸鼠成瘤细胞(B3 )的p5 3基因Exon 8的第2 82位密码子位置出现了一个G→T点突变,其编码的氨基酸由精氨酸(CGG)→亮氨酸(CTG)。结论　反式BPDE可诱导p5 3基因发生突变,提示p5 3基因突变可能是BPDE诱导细胞癌变的重要机制之一。     

脂蛋白脂肪酶外显子9基因突变研究

目的 :筛查国人脂蛋白脂肪酶 (LPL)外显子9基因突变和Ser447→stop突变频率 ,并探讨该突变对血脂水平的影响。方法 :依血脂测定结果 ,将169例分为高甘油三酯血症组(HTG组 ) ,48例和正常甘油三酯组(对照组 )121例 ,利用聚合酶链反应 -单链构象多态性和聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析技术对待测人群的LPL基因外显子9及其相邻内含子区域进行突变筛查 ,并对典型单链构象电泳图谱携带者进行PCR产物测序。结果 :在169例中检出1例Ser447→stop突变纯合子 ,50例Ser447→stop杂合子 ,未检出其它位点的突变 ;HTG组的Ser447→stop突变检出率 (25.0 % ,12/48)明显低于对照组 (31.4 % ,38/121) ,HTG组的Stop447 等位基因频率(12.5% )明显低于对照组 (16.5% ),两组比较差别均有统计学意义(P<0.01)。结论 :我国人群中LPL外显子9突变种类单一 ,Ser447→stop是一高频率的多态性位点 ,Stop447等位基因可能有轻微的降低血浆甘油三酯的作用。     

铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系研究

目的:研究铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系,并对聚合酶联反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)-DNA单链构象多态性(SSCP)分析铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变的可行性进行评估。方法:以铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因序列为靶序列,用PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、DNA测序等方法对铜绿假单胞菌ATCC27853及16株临床分离株gyrA基因突变进行对比研究。结果:在8株耐环丙沙星铜绿假单胞菌中,有6株gyrA基因的83位表现出单点突变,其突变方式全为ACC→ATC,导致氨基酸苏氨酸→异亮氨酸的改变;gyrA基因的PCR扩增产物SacⅡ酶切片段与测序结果一致;SSCP分析结果显示,16株细菌中仅2株gyrA带型与ATCC27853相同,其它菌株gyrA带型与ATCC27853均不同。结论:临床分离的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制主要表现为gyrA基因83位氨基酸密码子突变,应用PCR-RFLP-SSCP系统可快速、准确地检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌gyrA中碱基的变异。     

丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）核糖体插入位点（IRES）序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料。方法以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列,将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得355bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%。结论该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。     

应用噬菌体肽库筛选NMDA受体抗原表位

目的利用噬菌体展示随机肽库技术,进行NMDAR1抗原表位研究.方法以R1JHL单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体展示随机12肽文库.经过4轮的筛淘,ELISA结合实验鉴定阳性克隆,提取阳性克隆噬菌体单链DNA进行序列分析.结果对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序列分析,获得一阳性克隆序列HYNLSSDRKVRL,与R1JHL单克隆抗体识别序列相比,两者存在一致性序列DRK.结论 DRK可能为NMDA受体抗原表位.     

大鼠内皮抑素cDNA真核表达载体的构建及C6细胞上的分泌表达

目的构建分泌型大鼠内皮抑素(endostatin,endos)基因真核表达载体,并在C6细胞上获得表达。方法利用RT-PCR法从1日龄大鼠脑组织总RNA中扩增出endos基因,并将获得的基因重组入真核表达载体pBudCE4.1上。抽取经双酶切、PCR及测序鉴定后的重组子质粒,利用脂质体方法转染C6细胞,在Zeoc in抗性下筛选稳定表达endos的C6细胞克隆,W estern-b lot法检测阳性克隆子上清液中endos,免疫细胞化学鉴定endos在阳性克隆子上的定位,MTT法鉴定阳性克隆子分泌的endos的生物学活性,ELISA方法检测阳性克隆子上清液中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)含量。结果从1日龄SD大鼠脑组织总RNA中扩增出endos基因,构建重组质粒endo-pBud,经酶切、PCR和测序鉴定,产物大小及基因序列与预期值相符。经抗性筛选的阳性克隆子可分泌具有生物学活性的endos,同时其VEGF表达下调。结论成功获得endos基因,构建endos重组质粒,并在C6细胞上获得分泌性表达。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的构建糖类标记载体筛选克隆。方法以pPIC9K-βGl2为模板,通过PCR扩增得到全长的Bgl2基因片段,克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21(DE3),Cel-M9培养基筛选阳性克隆,经DNA测序分析,成功构建pET28a-Bgl2表达载体。SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。结果 PCR扩增得到Bgl2基因片段,SDS-PAGE显示蛋白以包涵体形式表达,克隆可用Cel-M9培养基筛选。结论用Cel-M9培养基筛选出阳性克隆为构建食品级载体奠定基础。     

麻疹H基因克隆及表达条件优化

目的克隆麻疹H蛋白基因,构建重组表达质粒,诱导表达蛋白。方法麻疹Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA,RT-PCR扩增H基因。用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切H蛋白基因片段和pET30a(+)载体,连接后获得重组质粒MV-H-pET30a(+),转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果 RT-PCR扩增片段长度约为1900bp,与MV-H基因相符。MV-H-pET30a(+)测序结果显示:MV-H基因对码正确,核苷酸序列符合率达99.7%。SDS-PAGE结果表明,菌体中含有特异性蛋白,大小约为86kD。结论在pET30a(+)成功克隆麻疹H基因,并有目的蛋白表达。     

红花总RNA的快速提取方法

目的：建立从红花组织中快速分离总RNA的方法，为进行反转录PCR（RT—PCR）、快速扩增cDNA末端（RACE）、蛋白质印迹法及其他分子生物学实验奠定基础。方法：采用改良Trizol法提取红花苞叶总RNA时，加入DNaseⅠ消化残留DNA，并加入RNase抑制剂，利用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行纯度和浓度检测。RT—PCR后，进行cDNA-序列相关扩增多态性（SRAP）分析。结果：抽提的RNA经电泳检测，可见28S、18S、5S RNA三条带，带的亮度强，且28S的宽度是18S的2倍左右。紫外吸光度D260／D280为1．8～2．0，D260／D230为2．0～2．3。总RNA产物进行cDNA-SRAP扩增，出现清晰的条带。结论：改良Trizol法所提取的RNA纯度高，质量好，完整性好，可成功进行cDNA-SRAP扩增。     

高危型HPV感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的相关性研究

目的研究与分析高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的相关性。方法本文选择番禺区本地户籍妇女进行调查研究,选择其中580例作为研究对象,随机分为三组,癌前病变组296例,宫颈癌组80例。对照组204例为宫颈无细胞学改变,采用宫颈刮片、宫颈液基细胞学检查法进行遴选筛查分析．同时应用达安PCR-反向点杂交法检测16种高危型HPV及3种低危型HPV,对各组检测结果进行比较分析。结果HPV总阳性率为51．03％（296／580）,癌前病变组、对照组以及宫颈癌组的HPV阳性率分别为66．89％（198／296）、10．29％（21／204）、96．25％（77／80）,3组患者感染率差异具有统计学意义（P〈0．05）。HPV分型的296例患者,高危型主要为HPV16型,占34．8％（103／296）。结论高危型HPV感染和宫颈癌以及宫颈癌前病变存在着紧密的联系,在高危型HPV感染当中最为主要的是HPV16。     

Nucleophosmin基因表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的克隆Nucleophosmin(NPM)的编码序列,构建含Nucleophosmin基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌多药耐药中的作用奠定基础。方法根据已发表的Nucleophosmin基因的核苷酸序列设计合成一对引物,以人乳腺癌组织抽提的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,用限制性内切酶酶切重组质粒pEGFP/NPM和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pEGFP/NPM导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组织化学法和RT-PCR鉴定其表达。结果 RT-PCR扩增出长894bp的特异性片段,经克隆至pEGFP-N1后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pEGFP/NPM在HepG2细胞中有稳定表达。结论成功克隆了NPM的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pEGFP/NPM/1,有助于对NPM基因在肝癌多药耐药中的机制做进一步研究。     

Molecular cloning and characterization of a platelet glycoprotein Ib-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri.

A platelet glycoprotein Ib-binding protein, termed TSV-GPIb-BP, was isolated from the venom of Trimeresurus stejnegeri. On SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, TSV-GPIb-BP showed a single band with an apparent molecular weight of 28,000 and two distinct bands with apparent molecular weights of 16,000 and 15,000 under non-reducing and reducing conditions, respectively. cDNA clones containing the coding sequences for both TSV-GPIb-BP subunits were isolated and sequenced. The deduced amino acid sequences of TSV-GPIb-BP subunits were confirmed by N-terminal protein sequencing and trypsin-digested peptide mass fingerprinting. Interestingly, the alpha subunit of TSV-GPIb-BP is identical to that of alboaggregin-B, and the sequence identity of their beta subunits is 94.3%. TSV-GPIb-BP inhibited ristocetin-induced human platelet agglutination in platelet-rich plasma under lower dosages (<5 microg/ml). On the other hand, it directly aggregated washed human platelets in the absence of additional Ca2+ or any other cofactors under higher dosages (>5 microg/ml). This platelet aggregation activity was dose-dependently inhibited by specific GPIbalpha antibodies, but not by those antibodies against platelet GPIa, GPIIa, GPIIb and GPIIIa.     

从化市婴幼儿急性呼吸道人类偏肺病毒感染与基因分析

目的了解从化市婴幼儿急性呼吸道人类偏肺病毒（humanmetapneumovirus,hMPV）感染的流行病学特点及临床特征,为防治hMPV感染提供指导依据。方法采集289例婴幼儿急性呼吸道感染鼻咽拭子标本,采用反转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）检测hMPV的核蛋白（N）基因,随机选取8例hMPV强阳性PCR产物进行测序和序列分析,同时对采集病例的临床资料进行统计学分析。结果289例标本中有20例（6．92％）为N基因阳性。2月份至4月份hMPV阳性检出率较高,以4月份最高（27．9％）,且多为1岁以内婴儿（80．0％）。hMPV阳性患儿的临床表现主要为卡他症状、发热、咳嗽、喘息、气促、肺部哕音和肺部影像学改变等,可引起上、下呼吸道感染。对N基因进行测序与序列分析,结果与GenBank中的序列比对,与北京株BJl897N基因的序列同源为97％。结论hMPV感染是从化市婴幼儿急性呼吸道感染的原因之一,发病高峰在4月份,且多为1岁以内婴儿。临床表现以咳嗽、喘息、肺部哕音和肺部影像学改变为主。8例hMPV阳性PCR产物核苷酸序列与北京株BJl897N基因的序列同源为97％。