HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05～50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P＜0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.     

表皮生长因子受体2靶向小分子干扰RNA对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的 探讨表皮生长因子受体2(HER-2)靶向小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌细胞顺铀敏感性的影响.方法 采用蛋白质印迹法筛选出特异性的HER-2 siRNA,将其转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞.将实验分为对照组(不转染HER-2 siRNA),非特异性siRNA组(转染非特异性siRNA),HER-2 siRNA组(转染特异性siRNA),3组分别加入0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、10、20 μg/ml不同浓度的顺铂,采用噻哗蓝法检测3组SKOV3细胞增殖情况;在给予1 μg/ml顺铂后,采用膜联蛋白V法检测顺铂组、HER-2 siRNA组与HER-2 siRNA联合顺铂组在不同时间(2～4 d)凋亡率变化的情况;应用蛋白印迹法检测顺铂组及HER-2 siRNA+顺铂组抗凋亡蛋白Bcl-2、存活素、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和促凋亡蛋白第二线粒体衍生蛋白酶活化子(Smac)的表达.结果 暴露于顺钠24 h后,3组细胞增殖率均随顺铂浓度的增加而降低,但降低的幅度不同,其中,转染HER-2siRNA组细胞降低最为显著;在给予1 μg/ml顺铂后,转染HER-2 siRNA组细胞增殖率[(58.1±4.7)%]与转染非特异性siRNA组[(65.3±2.7)%]、空白对照组[(68.5±2.8)%]相比,差异均有统计学意义(P＜0.01),而非特异性组与空白对照组之问差异无统计学意义(P＞0.05);HER-2 siRNA联合顺铂组细胞凋亡率明显增加,与单独使用顺铂及单独使用HER-2 siRNA组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).HER-2 siRNA联合顺铂组抗凋亡蛋白Bcl-2、存活素、XIAP明显低于顺铂组;促凋亡蛋白Smac明显高于顺铂组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HER-2 siRNA能增加卵巢癌SKOV-3细胞对顺铂的敏感性,显著诱导凋亡.HER-2 sIRNA联合顺铂对卵巢癌治疗具有协同作用.HER-2 siRNA和顺铂协同诱导细胞凋亡的机制可能与Bcl-2、存活素、XIAP蛋白质的下调、Smac蛋白质的上调有关.     

靶向survivin的siRNA联合顺铂抑制肺腺癌A549细胞增殖的实验研究

目的:研究靶向survivin的siRNA和顺铂联用对肺癌细胞A549的增殖抑制作用.方法:将A549细胞分为空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-Nc转染组,顺铂处理组,pSileneer2.0-SVV2转染组,pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组.转染采用脂质体法.MTT法检测靶向survivin的siRNA和顺铂对A549细胞增殖的抑制作用;RT-PCR法检测A549细胞survivinmRNA转录水平变化情况;流式细胞术和TUNEL.法检测A549细胞凋亡情况.结果:MTT法示:pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组增殖抑制率为51.38%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高,具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测显示空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-NC转染组,顺铂处理组survivinmRNA表达无明显变化(P>0.05).pSilencer2.0-SVV2转染组、pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组survivin mRNA表达明显下降(P<0.05);流式细胞术和TUNEL法检测pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组凋亡率分别为42.48%±2.28%和40.65%4±3.53%,与其它各组相比凋亡率明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论:将靶向survivin的siRNA和顺铂联合应用可以协同抑制A549细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用.     

小分子干扰RNA沉默果蝇zeste基因增强子同源物2对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响。方法培养宫颈癌Hela细胞,收集对数生长期Hela细胞继续培养,待贴壁细胞长满底部面积80%～90%时进行转染。将Hela细胞随机分为空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组,空白对照组Hela细胞不作处理,control siRNA组Hela细胞转染control siRNA,EZH2 siRNA组Hela细胞转染EZH2 siRNA。收集3组转染后Hela细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测Hela细胞中EZH2 mRNA表达,Western blot法检测Hela细胞中EZH2蛋白表达,流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期。收集3组转染后Hela细胞,分别加入不同质量浓度(0. 0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0、200. 0 g·L~(-1))的顺铂,48 h后采用四甲基偶氮唑蓝法检测Hela细胞在顺铂作用下的体外存活率。结果 Control siRNA和EZH2 siRNA可高效转染Hela细胞,转染率均达90%以上。空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量分别为396. 7±88. 4、389. 2±70. 6和98. 5±20. 3,EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量显著低于空白对照组和control siRNA组(t=2. 057、2. 015,P <0. 01),空白对照组与control siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(t=1. 476,P> 0. 05)。空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量分别为509. 4±110. 7、497. 5±80. 4和120. 4±31. 3,EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量显著低于空白对照组和control siRNA组(t=2. 682、2. 597,P <0. 01),空白对照组与control siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=1. 943,P> 0. 05)。EZH2 siRNA组G_0/G_1期细胞比例显著高于空白对照组和control siRNA组(t=2. 893、3. 087,P <0. 05),EZH2 siRNA组S期、G_2/M期细胞比例显著低于空白对照组和control siRNA组(EZH2 siRNA组与空白对照组比较:t=2. 526、5. 462,P <0. 05; EZH2 siRNA组与control siRNA组比较:t=2. 498、5. 417,P <0. 05),空白对照组与control siRNA组G_0/G_1期、S期及G_2/M期细胞比例比较差异均无统计学意义(t=0. 926、1. 017、0. 947,P> 0. 05)。不同质量浓度顺铂作用48 h后,同一质量浓度下EZH2 siRNA组Hela细胞的存活率明显低于空白对照组及control siRNA组(P <0. 05),且随着顺铂浓度的增加,3组Hela细胞的存活率均呈逐渐下降趋势。结论沉默EZH2表达可提高宫颈癌Hela细胞对顺铂的敏感性,而阻滞细胞周期可能是其主要作用机制之一。     

chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响

目的:观察卵巢癌SKOV-3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化.方法:用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV-3细胞的抑制率,Western Blot法检测SKOV-3细胞中Chk2蛋白的表达. 流式细胞仪及TUNEL法检测转染chk2反义寡核苷酸后顺铂作用下SKOV-3细胞凋亡情况.结果:顺铂对SKOV-3细胞的生长抑制率随浓度增高和时间延长而升高. Western Blot法检测证实转染chk2反义寡核苷酸后SKOV-3细胞中Chk2蛋白表达受到明显抑制. 流式细胞仪检测抑制chk2基因表达后SKOV-3细胞凋亡率为(77.6±1.7)%,明显高于正常组(24.7±1.76)%,空脂质体组(35.6±1.4)%及转染正义寡核苷酸细胞组(47.6±1.2)%. TUNEL法检测结果与流式细胞法一致.结论:chk2可作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.     

c-erbB-2反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC7901的影响

目的　观察c erbB 2反义寡核苷酸 (ASODN)对胃癌细胞株SGC790 1细胞的影响。方法　采用脂质体c erbB 2反义 (ASODN)组及空白对照、错配 (SCODN)组转染SGC790 1细胞 ,采用Westernblot观察c erbB 2蛋白表达的变化 ,采用四氮唑盐 (MTT)比色法测定细胞增殖以及对顺铂细胞毒性的影响。结果　转染ASODN能特异性下调c erbB 2蛋白表达和抑制胃癌细胞增殖。此外 ,顺铂在空白组、ASODN组及SCODN组的抑制率分别为 ( 3 3 .3± 2 .0 ) %、( 4 9.9± 5 .9) %和 ( 3 4.8± 3 .0 ) %。与空白对照组相比 ,ASODN组的抑制率显著增加 (P <0 .0 1)。结论　c erbB 2ASODN能抑制胃癌细胞的增殖并增强顺铂的细胞毒性     

靶向Her2基因SiRNA对人卵巢癌细胞株SKOV-3 顺铂敏感性的影响

目的通过siRNA沉默Her2基因的表达探讨其对卵巢癌细胞株SKOV-3顺铂（DDP）敏感性的影响。方法靶向Her2的siRNA通过阳离子脂质体介导转染到SKOV-3中,经过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2基因表达的SK-OV-3细胞株,通过RT-PCR方法检测各组SKOV-3细胞Her2基因的表达。应用四甲基偶氮唑蓝检测DDP对各组SKOV-3细胞增殖水平的影响,应用膜联蛋白V异-硫氰酸荧光素细胞凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测DDP作用后各组SKOV-3细胞凋亡水平。结果建立了稳定抑制Her2基因表达的细胞株,SKOV3/siRNA-1组和SKOV3/siRNA-2组细胞Her2基因表达分别为对照组的53.8%和38.4%,而空载体组为92.3%。在DDP作用下SKOV3/siRNA-1和SKOV3/siRNA-2的细胞存活率在4 d时分别为67.7%±4.4%和66.4%±3.3%,与未转染对照组81.7%±1.3%和空载体组81.3%±1.4%比较差异有显著性（P〈0.05）。FCM分析显示SK-OV3/siRNA-1和SKOV3/siRNA-2细胞的DDP诱导凋亡率分别为38.6%±1.1%和42.8%±1.4%,明显高于未转染组9.1%±0.8%和空载体组8.8%±0.7%,差异有显著性（P〈0.05）。结论靶向Her2基因的siRNA可以增强卵巢癌细胞株SKOV-3对DDP的敏感性。     

SiRNA沉默Livin基因促骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的:研究特异性小分子干扰RNA(siRNA)沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因对细胞凋亡的影响?方法:设计针对人源Livin基因的siRNA,转染至对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞株;RT-PCR检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达的变化,Western blot检测转染后骨肉瘤MG-63细胞Livin蛋白表达的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染后细胞凋亡的变化?结果:Livin特异性siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后,Livin基因表达较空白对照和阴性对照显著减少(0.195 ± 0.019 vs 0.539 ± 0.031?0.438 ± 0.029)?Western blot检测结果显示Livin蛋白质水平较空白对照和阴性对照显著减少(0.165 ± 0.022 vs 0.632 ± 0.034?0.625 ± 0.035)?流式细胞仪检测见siRNA组骨肉瘤MG-63细胞凋亡率较对照组明显增加?结论:RNA干扰能有效沉默骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达,促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡?     

bcl-2硫代反义寡核苷酸增强膀胱癌细胞对顺铂的敏感性

目的　研究凋亡抑制基因bcl 2硫代反义寡核苷酸 (S ODN)转染T2 4细胞后对顺铂药物敏感性影响。方法　将培养细胞分为 6组 :反义S ODN组 ,正义S ODN组 ,反义S ODN +顺铂组 ,正义S ODN +顺铂组 ,顺铂组和对照组。应用脂质体法介导bcl 2正义、反义S ODN转染T2 4细胞。通过免疫细胞化学方法观察细胞内BCL 2的蛋白表达 ,RT PCR方法检测细胞内bcl 2mR NA的相对表达量 ,MTT法测经顺铂 (cis platinum)处理的各组细胞的生成率 ,流式细胞仪 (FCM)检测细胞凋亡率。结果　bcl 2反义S ODN处理过的T2 4细胞中BCL 2蛋白和bcl 2mRNA表达明显下降。顺铂对反义S ODN组细胞的半抑制浓度 (IC50 )为 (2 .2 5± 0 .0 9) μg/ml显著低于正义S ODN组 (5 .83± 0 .15 ) μg/ml和对照组 (6 .11± 0 .2 1) μg/ml(P <0 .0 1)。顺铂处理反义S ODN组细胞的凋亡率显著高于其它组。结论　bcl 2反义S ODN能显著抑制T2 4细胞中BCL 2蛋白的表达并增强T2 4细胞对顺铂的药物敏感性     

Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞药物敏感性的研究

目的研究特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。方法应用两种特异性Survivin-siRNA（Survivin-siRNA,Survivin—siRNA,）转染骨肉瘤MG-63细胞,RT—PCR检测MG-63细胞Survivin-mRNA表达,流式细胞术检测MG-63细胞的凋亡,MTT法检测顺铂、多柔比星对转染前后MG-63细胞的半数抑制浓度（IC50）。结果特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞24h后SurvivinmRNA表达水平明显抑制;流式细胞术显示转染Survivin-siRNA的MG-63细胞48h后凋亡率明显高于非特异性siRNA组和空白对照组（F=17．32,P〈0．01）;特异性Survivin—siRNA增强了MG-63细胞对多柔比星的敏感性5倍,增强了MG-63细胞对顺铂的敏感性9倍。结论化学合成的Survivin—siRNA能有效抑制Survivin基因在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,并提高MG-63细胞对多柔比星、顺铂的敏感性。     

Her-2/neu小分子干扰RNA对肺腺癌细胞周期和凋亡机制的影响

目的研究人类表皮生长因子受体2(Her2/neu)小分子干扰RNA(siRNA)对Her2/neu过表达的肺腺癌细胞的细胞周期和凋亡机制的影响。方法用化学合成的靶向Her2/neusiRNA转染肺腺癌calu3细胞,转染前后通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定细胞中Her2/neu、细胞周期蛋白(Cyclin)D1mRNA水平;流式细胞术检测Her2/neu蛋白水平和细胞周期的变化;AnnexinⅤ异硫氢酸荧光素(FITC)试剂盒检测肺癌细胞的凋亡情况;荧光分光光度法测定Caspase3活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测培养液上清中血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果Her2/neusiRNA能在mRNA和蛋白水平下调肺癌细胞株calu3中Her2/neu基因的表达。calu3细胞转染Her2/neusiRNA48h后处于G0/G1期的细胞增多,同时S期的细胞比例减少,与未转染对照组、空载体组和非特异性siRNA组比较差异有统计学意义(F=6.1,P<0.01)。转染Her2/neusiRNA后CyclinD1mRNA水平下降,同时培养上清液中的VEGF含量为176pg/ml±6pg/ml(F=24.7,P<0.01),Caspase3活性为135%±4%(F=8.9,P<0.01),细胞凋亡率为25.1%±1.2%(F=10.3,P<0.01)。结论化学合成的靶向Her2/neusiRNA能够下调Her2/neu基因表达,继而降低CyclinD1和VEGF水平,激活Caspase3途径,从而阻滞细胞周期于G0/G1期和诱导凋亡。     

载体介导HER-2 RNA干扰治疗乳腺癌研究

目的 探讨载体介导HER-2RNA干扰治疗HER-2阳性乳腺癌的可行性。方法 构建能够产生HER-2 siRNA的质粒载体,利用载体转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3,利用RT-PCR与Western blot检测HER-2 mRNA与蛋白表达情况,同时观察转染后SKBR-3细胞凋亡及生长情况。结果 SKBR-3细胞HER-2受到载体介导的RNA干扰后．HER-2 mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞凋亡增加,肿瘤细胞生长受到抑制。结论 乳腺癌HER-2是理想的RNA干扰治疗靶点,靶向HER-2的RNA干扰可以诱导肿瘤凋亡,抑制肿瘤生长。     

siRNA抑制人卵巢癌KLK6基因表达的实验研究

目的探讨siRNA沉默KLK6基因表达对卵巢癌细胞生长的抑制作用及其机制,为卵巢癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对KLK6 mRNA序列设计合成siRNA,构建2个重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6和PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/Non;将重组质粒导入卵巢癌SKOV-3细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株;实验分为脂质体对照、阴性质粒转染对照及KLK6 siRNA重组质粒转染组,实时荧光定量PCR法检测KLK6 mRNA的表达的变化,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况。结果测序证实表达载体构建成功,在稳定转染重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6的卵巢癌SKOV-3细胞株中,KLK6 mRNA抑制率（76%）明显高于阴性质粒对照组（2.7%）,SKOV-3细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组。结论重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6可抑制卵巢癌细胞中KLK6基因的表达,并抑制卵巢癌细胞的生长。     

沉默Nek2基因对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响

目的：研究RNA干扰NIMA相关激酶2（Nek2）表达对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期的影响及其相关的分子机制。方法将针对Nek2基因的siRNA转染至SKOV3细胞中,采用流式细胞技术检测SKOV3细胞周期变化,并用Westernblot技术检测Nek2‐siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48h后,与细胞周期相关的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表达水平以及ERK1／2磷酸化水平的变化。结果空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组中处于G2／M期的细胞比例分别为13．72％、12．27％和1．56％,与两对照组比较,处于G2／M期的干扰组细胞明显减少（P＜0．05）。Nek2基因沉默后,与两对照组比较,SK‐OV3细胞内cyclinB1和CDK1的蛋白表达水平明显下降,P27的蛋白表达水平明显上调,SKOV3细胞内ERK1／2磷酸化水平明显下降（P＜0．05）。结论沉默Nek2基因,可阻止卵巢癌SKOV3细胞启动有丝分裂,从而抑制其增殖。     

HER-2／neu·siRNA表达载体的构建及对人乳腺癌细胞株的影响

目的：探讨siRNA对人乳腺癌细胞株SK—BR-3的HER-2／neu基因表达的影响。方法：以HER-2／neu mRNA序列为模板设计合成2对siRNA序列,构建pGenesil-1-HER-2／neusiRNA重组质粒,转化感受态的大肠杆菌,质粒酶切、测序鉴定。转染SK—BR-3细胞48h后,提取RNA进行RT—PCR,采用方差分析（ANOVA）,分析RNA干扰效应。结果：成功构建了pGenesil-1-HER-2／neu siRNA重组质粒,成功转染SK—BR-3细胞。重组质粒抑制HER-2／neu基因的表达接近54．45％（P=0．000）。结论：HER-2／neu siRNA重组质粒明显下调HER-2／neu基因在乳腺癌细胞中的表达。     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

应用siRNA技术下调survivin基因表达以增强SGC7901胃癌细胞对顺铂的敏感性

目的利用小干扰RNA（siRNA）技术特异性下调survivin基因的表达,检测SGC7901胃癌细胞转染前后对顺铂敏感性的变化。方法实验分为空白对照组（control组）、单用顺铂组（CDDP组）、脂质体组（Lip组）、单用survivin siRNA组（siRNA组）、转染survivin siRNA（转染组）及转染survivin siRNA联合顺铂作用组（联合作用组）。人工合成survivin siRNA,通过Lip包裹将siRNA转染胃癌细胞SGC7901,荧光显微镜下观察转染情况。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,Western blot及免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态改变。结果Hoechst染色荧光显微镜下control组、Lip组及siRNA组细胞核呈正常的蓝色,而CDDP组、转染组及联合作用组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;联合作用组细胞增殖抑制率（63.93±4.22）%明显高于其余各组（P〈0.05）;转染组及联合作用组survivin蛋白表达明显低于其他各组（P〈0.05）。结论应用siRNA技术下调SGC7901胃癌细胞中survivin基因的表达,能够增加其对顺铂的药物敏感性。