大肠癌相关抗原CA—Hb3的纯化及其在胃肠道肿瘤血清学诊断中…

用一株鼠抗人大肠癌单克隆抗体Ｈｂ３，纯化后与溴化氰活化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制备免疫吸附柱。用免疫亲和层析法从大肠癌细胞株ＨＲＴ－１８细胞提取液中纯化相应抗原ＣＡ－Ｈｂ３。经多种实验证实ＣＡ－Ｈｂ３是一种新的大肠癌相关糖蛋白抗原，分子量约为６５Ｋｄ，以此纯化抗原作参考标准，用ＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ方法检测大肠癌及消化道其他肿瘤患者血清ＣＡ－Ｈｂ３水平。结果表明，ＣＡ－Ｈｂ３对胃肠道肿瘤诊断     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及其特性研究

本文采用亲和层析法纯化的甲胎蛋白（ＡＦＰ）抗原免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞系融合，获三株分泌抗人ＡＦＰ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞系。用ＥＬＩＳＡ阻断试验和夹心ＥＬＩＳＡ试验作特异性鉴定，杂交瘤细胞株染色体的众数为１０４条，三株细胞系ＭｃＡｂ均属小鼠ＩｇＧ１型。经体外连续传代３个月及冻存一年复苏后均能持续分泌抗ＡＦＰ抗体。     

大肠癌相关抗原CA－Hb_3的纯化及其在胃肠道肿瘤血清学诊断中的应用

用一株鼠抗人大肠癌单克险抗体Ｈｂ３，纯化后与溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制各免疫吸附柱。用免疫亲和层析法从大肠癌细胞株ＨＲＴ－１８细胞提取液中纯化相应抗原ＣＡ－Ｈｂ３。经多种实验证实ＣＡ－Ｈｂ３是一种新的大肠癌相关糖蛋白抗原、分子量约为６５Ｋｄ．以此纯化抗原作参考标准，用ＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ方法检测大肠癌及消化迟其他肿瘤患者血清ＣＡ－Ｈｂ３水平。结果表明，ＣＡ－Ｈｂ３对胃肠运肿瘤诊断的敏感性和特异性较高，具有一定的临床价值。     

人胰磷脂酶A2纯化及单克隆抗体的制备

为建立磷脂酶Ａ２免疫检测法，纯化ＰＩ２Ａ２，将胰组织匀浆加热、离心去除沉积，上清过ＣＭ－ｓｅｐｈａｄｅｘＣ－２５ｓｙｇｇ，ｎｈ ｗｙｓ ｅ ＰＬＡ２的部分，纯化ＰＬＡ２样品经ＳＤＳ－ＦＡＤＥ电 一条区带。纯分的ＰＬＡ２作为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，抗体产生后与骨髓瘤细胞融合，在ＰＧＥ－４０００促融下，融合为杂交瘤细胞株经ＥＬＩＳＡ法鉴定筛选出分泌抗ＰＬＡ２的细胞株，扩大培养后将杂交瘤细胞注射小鼠腹     

胆固醇酯转运蛋白的提纯和鉴定

目的：分离纯化人血清胆固醇酯转运蛋白（ＣＥＴＰ），为制备ＣＥＴＰ单克隆抗体和ＣＥＴＰ浓度测定提供物质基础。方法：制备无脂血清，用Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ、ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００三步柱层析分离、纯化ＣＥＴＰ。结果：纯化的ＣＥＴＰ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与ＣＥＴＰ特异性单克隆抗体免疫反应和活性测定等鉴定证实为纯化ＣＥＴＰ。结论：经三步柱层析获得了纯化ＣＥＴＰ，得率约２５％，活性３０ｎｍｏｌ／（μｇ·ｈ）。     

活化B淋巴细胞与NS1瘤细胞融合瘤苗的抗肿瘤免疫治疗

观察活化Ｂ淋巴细胞与ＮＳ１骨髓瘤细胞融合瘤苗对荷ＮＳ１瘤ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠免疫治疗作用。方法用灭活ＮＳ１瘤细胞及其裂解物免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠活化的Ｂ淋巴细胞；以５０％ＰＥＧ为融合剂，将免疫脾Ｂ淋巴细胞与野生型ＮＳ１骨髓瘤细胞融合，经ＨＡＴ选择性培养，筛选融合细胞，     

八肽偶联白蛋白的免疫

用硫酸铵盐析法提纯ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠血清白蛋白，并用人工合成的八肽通过偶联剂（ＭＢＳ）与小鼠血清白蛋白联后后作为免疫原，对ＢＡＬＢ／Ｃ，小鼠进行免疫，获得了对纤维蛋白有特异性的抗体，血清抗体效价达１：８００。     

丙肝核酸免疫效果初步观察

目的 观察丙肝核酸疫苗的免疫效果。方法 用丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１区基因的真核表达重组质粒ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１免疫蛇毒预处理的ＢＡＬＢ／Ｃ和Ｃ５７ＢＬ小鼠，两周后采用ＥＬＩＳＡ法开始检测抗体滴度。结果 真核表达重组质粒ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１免疫能诱导习免疫应答，产生高水平的特异抗体。特别是Ｃ５７ＢＬ小鼠抗体反应最好，初次免疫就能产生高水平的特异抗体，加强后能持续数周，最高滴度ＯＤ值达１．４５。结     

应用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体

目的：纯化单克隆抗体（ 单抗,ＭｃＡｂ） 。方法：应用Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ制备免疫亲和层析柱,纯化载脂蛋白（Ａｐｏ）Ｅ４、ＡｐｏＥ６、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎＩＮＨ）α、βＡ、βＢ５ 种ＭｃＡｂ。结果：ＭｃＡｂ 纯化后电泳呈一条带,并有较好的免疫活性。结论：应用蛋白Ａ亲和层析法可以纯化ＭｃＡｂ。     

一株抗人胆管癌相关抗原杂交瘤细胞株的建立及鉴定

目的 建立能分泌与人胆管癌组织特异结合的高效价抗人胆管癌相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法 用２的人胆管癌细胞系Ｓｋ－ＣＨＡ－１免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，获取免疫小鼠的脾细胞。与小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０融合，ＥＬＩＳＡ方法及免疫荧光染色法筛选细胞晤后生成的杂交瘤细胞株。结果 ＥＬＩＳＡ方法及免疫荧光染色法共筛选出５株能持续稳定分泌抗人胆管癌相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中２Ｆ４Ｅ８杂交瘤细胞株     

人PINK1抗血清的制备及其免疫活性物质在大鼠脑组织中的表达

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。     

肌球蛋白结合蛋白C的表达和鉴定

目的：探讨优化原核表达方法以及用亲和层析的方法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C （MYBPC2）.方法：根据MYBPC2的序列设计一对引物,在上下游引物的5’端分别加上BamHI和HindⅢ酶切位点.以健康人骨骼肌cDNA为模版,扩增第284位至第579位氨基酸残基对应的碱基序列,经双酶切后插入pMalc-5e载体中,测序鉴定重组质粒的序列,将构建好的重组质粒转化大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白MYBPC2-MBP的表达,亲和层析纯化重组蛋白,蛋白电泳法鉴定蛋白的分子量及纯度,测定蛋白浓度并估算蛋白纯化后得率.用商品化的抗MYBPC2抗体证实所表达蛋白序列的正确性.以纯化的蛋白免疫动物获得动物免疫血清,用Western Blot的方法鉴定此蛋白的免疫原性.结果：人MYBPC2蛋白表达载体构建成功,每升大肠杆菌菌液可生产纯化后的重组MYBPC2蛋白约30mg,Western Blot显示重组蛋白与其抗体及抗血清特异结合.结论：本方法可以高效制备生产人MYBPC2蛋白片段,具备良好的抗原特异性和免疫原性.     

人I型谷丙氨酸氨基转移酶的原核表达及抗血清的制备

目的：构建人谷丙氨酸氨基转移酶（ALT1）的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫家兔,制备ALT1抗血清．方法：从HepG2细胞中提取总RNA,RT—PCR扩增alt1基因,并将其克隆人pMD19-T载体中测序,将测序正确的目的基因克隆至PET-32a（＋）表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、WesternBlot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA,WesternBlot进行检测．结果：测序证实克隆的基因序列与GenBank中的ALT1序列相符;SDS—PAGE,Westernblot结果证实获得Mr为75×10^3的ALT1融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni^2＋亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1：100000,WesternBlot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合．结论：获得了ALT1重组蛋白及特异性多克隆抗体．     

三种鸡形目雉科禽类卵黄抗体的纯化及二抗的制备

目的纯化三种鸡形目雉科的禽类孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,并且免疫家兔制备抗血清。方法采用了水稀释法,HiTrap IgYPurification HP免疫亲和层析法和硫酸铵沉淀法纯化IgY。免疫家兔制备抗血清,免疫双扩散法测定效价。Protein-A亲和纯化兔抗IgY血清IgG。结果经亲和纯化和盐析纯化,得到了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,经SDS-PAGE检测为电泳纯,孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的相对分子质量约为180×103。免疫后经Protein-A亲和纯化后获得了兔抗IgY的IgG。结论证实了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的存在及其特性。雉科鸡形目禽类卵黄抗体的纯化方法相似,可以推广到鸡形目其它禽类的卵黄抗体的纯化中,获得的抗血清可以进一步进行标记和今后抗原的检测。     

乙酰胆碱酯酶在家兔小脑内的分布

研究了11只家兔小脑内AChE活性的分布。采用改良的经典组织化学技术来显示AChE活性。小脑皮质颗粒层一般有很强的AChE活性,而浦肯野细胞层的分子层的浅部则呈AChE反应阴性。分子层的深部和小脑白质的AChE活性较弱。而且有很多阳性神经元出现在后叶的分子层中,以X小叶最为密集。在小脑白质中,发现5条与正中面相平行的AChE活性较强的纵带。其中蚓状正中面上的正中带出现在除Ⅵ、Ⅶ小叶以外的各小叶中;对称分布的内侧带出现在前叶的Ⅱ到Ⅴ小叶和后叶的Ⅷ、Ⅸ小叶;外侧带只出现在Ⅸc和Ⅸd分叶。小脑中央核显示很强的AChE活性。在颗粒层的胶质细胞和白质中发现有丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性,而且在近颗粒层的白质活性更强。     

从噬菌体随机十二肽库中筛选乙酰胆碱酯酶的抑制肽

目的从随机肽库中筛选乙酰胆碱酯酶（ACHE）的抑制性多肽。方法以人AChE作为靶标，应用噬菌体随机12肽库进行筛选，经过3轮筛选，对阳性克隆进行测序并进行序列分析及抑酶活性测定。结果筛选得到6个能与人AChE较强结合的噬菌体克隆，其中有4个克隆可以抑制AChE的酶活性，其保守序列为W（S／P）HY。结论通过噬菌体肽库技术能够筛选到抑制人AChE活性的多肽，为进一步研究AChE的多肽抑制剂奠定了基础。     

抗人α-synuclein多克隆抗体的制备和鉴定

制备特异性抗人α synuclein抗血清 ,用于α synuclein相关退行性疾病及病理状态的研究。用重组人α synuclein免疫BALB/C小鼠 ,Dotblot、Westernblot及免疫组化法鉴定所获抗血清。Dotblot显示该抗血清可识别高于5 0ng的重组α synuclein。Westernblot分析表明此抗血清可识别人及大鼠脑匀浆中相对分子质量为 1 .8万的蛋白质 ,与以往报道α synuclein的相对分子质量一致。免疫组化染色显示α synuclein免疫活性物质广泛分布于皮质、海马、纹状体、杏仁核和嗅球 ,主要集中于神经元核周胞质及神经末梢。提示 :所制备的抗血清可特异性识别人及大鼠脑中的α synuclein ,该抗体对α synuclein相关疾病的研究具有应用价值     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

髓鞘相关蛋白Nogo-A在纯化细胞核中的表达

目的：检测Nogo-A蛋白在纯化后的大鼠脊髓和小脑细胞核中的表达。方法：通过差速离心法得到大鼠脊髓和小脑样本的各亚细胞成分,利用非离子性去污剂NP-40纯化细胞核组分,采用Western blot方法检验核纯度并检测Nogo-A在各亚细胞成分中的表达。结果：纯化的细胞核抽提物中检测到特异的Nogo-A反应条带。结论：Nogo-A在纯化的细胞核中仍有明确表达,进一步证明了Nogo-A蛋白在中枢神经元的细胞核中有定位,并提示Nogo-A很可能以全长形式入核。     

猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究

目的 :通过研究猪鼻支原体 (Mhy)相关抗原在人肿瘤细胞的表达情况 ,以初步探讨Mhy与肿瘤的关系。方法 :通过培养Mhy提取其抗原 ,免疫家兔后获得其特异性抗血清 ,然后使用链霉亲和素 生物素过氧化物酶(SABC)方法 ,检测 32例人结肠腺癌和 5例胚胎不同组织细胞标本。结果 :Mhy相关抗原在 2 9例癌细胞胞膜及胞浆中有表达 ,在癌周正常组织细胞和胚胎细胞无表达 ,阳性率 90 .6 %。结论 :人某些恶性肿瘤细胞胞浆及胞膜存在Mhy相关抗原 ,作为一种新的肿瘤标志物用于恶性肿瘤的检测以及在研究支原体与人恶性肿瘤的关系方面具有一定的理论和实际意义。