靶向hTERT的小干扰RNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的机制

[目的]研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的 siRNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的分子机制。[方法]化学合成的靶向hTERT的siRNA以脂质体法转染PC3细胞;应用寡核苷酸芯片技术分析细胞凋亡相关基因的转录谱变化;应用Westernblot检测细胞中hTERT、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL、凋亡抑制基因Bcl-2和胞浆Cytc的蛋白水平变化;流式细胞术分析细胞凋亡率变化;比色法测定Caspase-3和Caspase-8的相对活性改变。[结果]靶向hTERT的siRNA能有效抑制hTERT基因表达;转染hTERT-siRNA48h后可引起TRAIL的表达上调,Bcl-2表达下调,Cytc释放增加,Caspase-3活性增强,细胞凋亡率升高。[结论]靶向hTERT的小干扰RNA通过活化线粒体信号传导途径诱导PC3细胞凋亡。     

端粒酶永生化原始乳腺癌组织来源细胞及其意义

背景与目的：乳腺癌细胞系大部分来源于乳腺癌转移所致的胸水或非原始乳腺癌组织来源，与真正的乳腺癌的生物学性状有很大差异。而仅部分细胞系直接由乳腺癌原代细胞在体外培养条件下成为永生化的细胞系，过表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）可使正常人上皮细胞永生化。本研究将通过hTERT转染人原始乳腺癌组织来源的细胞建立永生化乳腺癌细胞系，并研究过表达hTERT对其他基因表达的影响。方法：通过重组逆转录病毒pBABE-hTERT-puro将hTERT基因导人原始乳腺癌组织来源的细胞，建立稳定表达hTERT的永生乳腺癌细胞。再利用微阵列技术检测乳腺癌细胞中hTERT诱导的基因表达改变。结果：Real-TimeRT-PCR证实hTERT转染后的乳腺癌细胞中hTERT过度并稳定表达，为转染前表达量的1400倍以上，并使得被转染的细胞永生化，可以传40～50代以上。微阵列结果进一步证实hTERT在转染后的细胞中过表达，另外，有22个基因在转染后的乳腺癌细胞中上调，未观察到所有细胞株中均下调的基因。结论：过表达hTERT可导致乳腺癌原代细胞的永生化，并对部分基因有上调作用。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

RNAi抑制hTERT基因治疗乳腺癌的实验研究

目的利用siRNA在乳腺癌细胞内诱导RNAi，抑制hTERT基因表达，在体外细胞水平探讨RNAi对乳腺癌治疗的可行性。方法构建靶向hTERT基因的siRNA（hTERT-siRNA），转导入乳腺癌MCF-7细胞，在瘤细胞内诱导RNAi，采用细胞增殖抑制实验、RT—PCR法、Westernblot等技术检测siRNA处理前后瘤细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果hTERT-siRNA对乳腺癌细胞生长抑制率达43％；hTERT基因的mRNA表达明显降低，蛋白表达平均下调了39．8％。结论siRNA在体外明显抑制了乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT)的短发夹RNA（shRNA)对人鼻咽癌细胞株CNE-2 hTERT表达的影响,及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的效应。方法构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因和靶向hTERT基因短发夹RNA的重组腺病毒质粒,观察其对鼻咽癌细胞株(CNE-2)的转染效果,RT-PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡状况。结果Adv-EGFP-shTERT重组腺病毒质粒转染率可达90%以上,成功转染CNE-2细胞24 h后,hTERT mRNA的表达水平显著下降,转染48 h后,hTERT蛋白表达明显下调,细胞增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡率可达23.0%。结论腺病毒载体介导靶向hTERT基因的RNA干扰,能显著抑制端粒酶反转录酶表达,进而抑制端粒酶活性,抑制CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌的基因治疗研究提供了理论基础。     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

hTERT 短发夹状RNA 抑制前列腺癌细胞生长的研究

 目的 研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。方法 在脂质体介导下将针对hTERT基因的shRNA表达载体psilencer-TRT转染前列腺癌细胞PC-3m，得到稳定细胞株PC-3m／shRNA-TRT。采用RT-PCR检测hTERT基因表迭情况，western blot分析各组细胞hTERT及c-myc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 重组质粒psilencer-TRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调，抑制率约为89．02％；同时实验组细胞hTERT及c-myc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（P〈0．05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为（19．69±4．75）％。结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC-3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。     

Gene expression profiling to identify markers associated with deregulated hTERT in HPV-transformed keratinocytes and cervical cancer

Although high-risk human papillomavirus (HPV) infection plays a major role in the development of cervical cancer, additive oncogenic events are involved as well. One key event involves increased activity of telomerase resulting from a deregulated expression of its catalytic subunit hTERT. Our previous microcell-mediated chromosome transfer studies revealed that introduction of human chromosome 6 in the HPV16-immortalized keratinocyte cell line FK16A and in the HPV16-containing cervical cancer cell line SiHa induced growth arrest, resulting from a repression of hTERT mRNA expression and telomerase activity. Here, this model was used to analyze expression profiles associated with hTERT deregulation in HPV-transformed cells. Microarray expression analysis of 12 FK16A/chromosome 6 hybrids, 4 of which were negative for endogenous hTERT and 8 of which were positive for endogenous hTERT, resulted in the identification of 164 differentially expressed genes. Differential expression of a selection of 5 genes was verified by real-time RT-PCR. Of these 164 genes, 32 were also differentially expressed in other HPV transformed cells with deregulated hTERT. For 2 of these genes, encoding AQP3 and MGP, altered expression in hTERT positive cervical carcinomas was confirmed by real-time RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. Moreover, increased MGP protein expression was significantly more frequent in high-grade cervical premalignant lesions with elevated hTERT mRNA expression compared to those without. In summary, we identified 32 candidate biomarkers for deregulated hTERT mRNA expression, which may enable the identification of cervical premalignant lesions that are at highest risk to progress to invasive cancer.     

RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究

背景与目的：RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的hTERT基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法：设计干扰hTERT基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTzu6 1-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT—PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组hTERT基因表达及细胞增殖变化,结果：体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6 1—shRNA—hTERT导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37．5％;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1／G0期细胞显著增加;hTERT的mRNA表达由99．4％下调到53．1％,hTERT蛋白表达由86．3％下调到46．6％。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZu6 1-shRNA-hTERT注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,hTERT的mRNA表达由99．1％下调到76．2％,hT．ERT蛋白表达由87．2％下调到61．8％。体内、外对照组各指标均无变化。结论：RNAi明显抑制了靶基因hTERT的表达及肝癌细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法。