体外培养鉴定恒河猴结膜上皮细胞的研究

[目的]通过在体外培养鉴定恒河猴结膜上皮细胞,探讨结膜上皮细胞的正常的生长环境,为深入研究眼表疾病的发病机理奠定基础.[方法]取健康恒河猴结膜上皮在体外进行分离培养,通过组织块培养法进行原代培养,传代培养后进行鉴定.分别采用倒置显微镜观察,细胞免疫化学,以及RT-PCR技术进行鉴定.[结果]恒河猴结膜上皮细胞在24 h内从组织块爬出,上皮细胞成层状向周边铺展,平均7 d左右细胞可以融合成单层.原代培养生长的细胞以结膜上皮细胞为主,混杂有少许的成纤维细胞.传至第3代细胞,基本纯化为上皮细胞,无成纤维细胞混杂.原代和第1、2、3代的结膜上皮细胞,皆呈现细胞胞浆粘蛋白4和角蛋白4阳性.但是,原代的部分细胞呈现MUC5AC和角蛋白7染色阳性,第1代少数细胞染色阳性,而第3代细胞基本上未见阳性细胞.原代培养的细胞进行RT-PCR检测,显示421 bp和632 bP明亮的特异性条带.[结论]对恒河猴结膜上皮体外取材培养,可以获取纯度较高的结膜上皮细胞,其生理特征与体内相同,可以在体外模拟类似的眼表环境.     

体外培养人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达

目的　探讨体外培养的人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达。方法　采用免疫荧光细胞计数检测法 ,对 2 0例先天性白内障患者术中的环形撕裂前囊膜进行原代培养并传代 ,取 2～ 3代细胞进行检测整合素α5的表达。结果　体外培养人眼晶状体上皮细胞整合素α5的表达阳性率平均为 93 .3 0 % ,阴性率为 6.70 %。结论　体外培养人眼晶状体上皮细胞高表达整合素α5 ,其可能在后发性白内障的发生和发展过程中发挥作用。     

体外培养大鼠耻骨联合软骨细胞的生物学特性

[目的]通过对大鼠耻骨联合软骨细胞的分离及体外培养,观察其生长、表型等一般生物学特点.[方法]采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化法,从SD大鼠耻骨联合软骨组织中分离出软骨细胞,用含150mL/L胎牛血清的DMEM/F-12培养液原代和传代培养.分别以2g/L胶原酶消化2、6、12 h,分析不同消化时间获取的细胞数量及生长情况.对6 h消化组细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,并观察第1、4、7代的生长曲线.[结果]经胶原酶消化2、6、12 h后,平均每100mg耻骨联合软骨获取的原代细胞数之间有统计学显著差异（P＜0.01）.消化6 h组可以获取数量丰富的原代细胞,生长状态好.大鼠耻骨联合细胞原代呈短梭形、三角形或多角形,有短细胞突起.Ⅱ型胶原免疫组化染色在第1、4代培养细胞均呈阳性,第7代培养细胞呈阴性.第7代细胞生长增殖比第1、4代慢.[结论]耻骨联合软骨细胞体外培养时属于有限细胞系.培养初期（第4代之前,含第4代）的细胞较好地保持了软骨细胞的表型,且增殖能力强,有可能作为软骨组织工程的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的：分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨其生物学特性,为组织工程和基因工程提供优势靶细胞。方法：全骨髓细胞贴壁法进行BMSCs的原代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原,MTT法检测BMSCs增殖能力,并绘制生长曲线。结果：原代培养24h后看见少量贴壁细胞,初起为小圆形,3d后可见梭形类似成纤维细胞,呈漩涡样生长,传3~6代细胞均一性良好,10代以后细胞逐渐有宽大梭形样变,增殖减慢,偶有细胞漂浮、死亡。流式细胞仪检测传3代细胞CD29表达率为92%,CD34几乎无表达。生长曲线显示,传3、6代BMSCs有较强的增殖能力,其中传6代细胞更为明显,传10代细胞的增殖能力较前有所减弱。结论：成功从大鼠骨髓组织分离、培养BMSCs,纯度高,生物学特性符合正常干细胞生长规律,是组织工程和基因工程理想的靶细胞。     

晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及凋亡相关基因caspase-3表达与老年性白内障

目的 探讨晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及凋亡相关基因caspase-3表达与老年性白内障发生的关系.方法 选择32例老年性白内障患者晶状体前囊膜标本(白内障组),同时收集高度近视患者晶状体前囊膜标本28例(高度近视组).采用免疫组化法检测两组的晶状体前囊膜组织中凋亡相关基因caspase-3的表达,并应用TUNEL法检测两组LECs的凋亡情况.结果 白内障组LECs中凋亡细胞百分率(30.4±3.7)％,明显高于高度近视组LECs中凋亡细胞百分率[(0.27±0.12)％],差异有统计学意义(P＜0.05).白内障组LECs中caspase-3蛋白的阳性表达率为84.38％,明显高于高度近视组LECs中caspase-3蛋白的阳性表达率(10.71％),差异有统计学意义(P＜0.05).等级Logistic回归分析显示:老年性白内障患者的LECs中caspase-3蛋白的表达明显高于高度近视组(P＜0.01).结论 LECs的凋亡及caspase-3的表达在老年性白内障的发生发展过程中起重要作用.     

体外培养大鼠耻骨联合软骨细胞的生物学特性

 [目的]通过对大鼠耻骨联合软骨细胞的分离及体外培养,观察其生长、表型等一般生物学特点.[方法]采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化法,从SD大鼠耻骨联合软骨组织中分离出软骨细胞,用含150mL/L胎牛血清的DMEM/F-12培养液原代和传代培养.分别以2g/L胶原酶消化2、6、12 h,分析不同消化时间获取的细胞数量及生长情况.对6 h消化组细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,并观察第1、4、7代的生长曲线.[结果]经胶原酶消化2、6、12 h后,平均每100mg耻骨联合软骨获取的原代细胞数之间有统计学显著差异（P＜0.01）.消化6 h组可以获取数量丰富的原代细胞,生长状态好.大鼠耻骨联合细胞原代呈短梭形、三角形或多角形,有短细胞突起.Ⅱ型胶原免疫组化染色在第1、4代培养细胞均呈阳性,第7代培养细胞呈阴性.第7代细胞生长增殖比第1、4代慢.[结论]耻骨联合软骨细胞体外培养时属于有限细胞系.培养初期（第4代之前,含第4代）的细胞较好地保持了软骨细胞的表型,且增殖能力强,有可能作为软骨组织工程的种子细胞.     

流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

[目的]用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达,根据结果优化其转染表达条件.[方法]以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记,用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP/VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达,根据结果优化pIRES-EYFP/VEGF121转染表达条件.[结果]pIRES-EYFP/VEGF121得以成功构建,并转染大鼠原代培养肝细胞;优化的转染表达条件:在细胞数密度0.1×106/mL,质粒孵育时间30 min,质粒与脂质体混合物孵育时间15 min,质粒与脂质体比例为1:10,转染时间2 h,NAIR-1作转染培养液时,转染效率达17.5%.[结论]以EYFP为标记,FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达,可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础.     

改良的兔晶体上皮细胞体外培养

目的:建立一种改良的兔晶状体上皮细胞体外培养的方法,提高晶体上皮细胞原代培养的成功率。方法:利用改良消化法对兔晶体上皮细胞进原代培养,对培养的细胞进行形态学观察。结果:接种48小时~72小时后即可见上皮细胞贴壁生长,具备上皮细胞的形态特点;约7天后融合。传至5代后,细胞明显成纤维细胞化。结论:此种方法经济简便,可为各种实验提供兔晶体上皮细胞。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

犬骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的 研究探讨犬骨髓间充质干细胞的分离、培养方法以及生长增殖特性.方法 无菌技术抽取比格犬骨髓,密度梯度离心法获取细胞.加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中进行原代培养;待细胞生长至80%～90%融合时,1:3传代培养.倒置显微镜观察细胞形态.MTT法测定3、5和10代细胞生长曲线.流式细胞仪检测第5代细胞的表面抗原分子.结果 原代培养24h后看见微少贴壁细胞,初起为小圆形,3 d后可见梭形类成纤维细胞呈漩涡样生长.10代以后细胞逐渐有宽大梭形样变,增殖逐渐减缓,偶有细胞飘零.流式细胞仪检测传5代细胞有96%表达CD44,95%表达CD29,而只有5%表达CD34.生长曲线显示,传3、5代骨髓间充质干细胞均有较强的增殖能力,其中传3代细胞更为明显,而传10代细胞的增殖能力较前有所减弱.结论 犬骨髓间充质干分离提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,能够长期培养,符合组织工程种子细胞的基本条件.     

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的 探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法 采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果 分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×10⁵ TCID₅₀/mL。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论 确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

晶状体上皮细胞培养特征及细胞因子对其增殖影响的实验研究

目的 探讨体外培养的牛晶状体上皮细胞的培养方法及特性，并研究γ-干扰素（γ-inter-feron,γ-IFN）对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。方法 牛晶状体上皮细胞原代与传代培养，第2代培养细胞中添加γ-IFN，浓度10^1-10^5U/ml，通过甲基噻唑基四唑（MTT）测定法，观察γ-IFN对晶状体上皮细胞的影响。结果 γ-IFN在体外有抑制牛晶状体上皮细胞增殖作用。并以10^4U/ml最为明显。结论 γ-IFN可抑制晶状体上皮细胞增殖作用。因而能抑制后发障的形成。     

E-cadherin基因在卵巢癌高低转移细胞中的差异表达及其机制的探讨

[目的]探讨上皮性细胞黏附分子在人卵巢浆液性囊腺癌高、低转移细胞株HO-8910和HO-8910PM的表达情况.[方法]采用蛋白印迹及免疫细胞化学方法检测2种细胞株的E-cadherin蛋白表达差异,用RT-PCR法检测2种细胞株的mRNA表达差异,用PCR及基因测序法检测基因突变情况.[结果]E-cad蛋白及mRNA在HO-8910中表达,在HO-8910PM中不表达.在E-cadherin基因外显子6～9未发现突变.[结论]E-cad的表达可能与肿瘤的转移能力负相关.     

从兔乳汁分离原代乳腺上皮细胞用于乳腺特异性启动子活性检测

目的在含牛α-S1-酪蛋白调控序列的乳腺特异性定位表达载体pCA1基础上，构建乳腺细胞绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，转染分离培养的兔原代乳腺上皮细胞并检测启动子活性与组织特异性．方法用PCR法获取绿色荧光蛋白基因（即GFPuv基因），将其重组到乳腺特异性定位表达载体pCA1中，构建乳腺细胞特异绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，直接从兔乳汁中分离兔原代乳腺上皮细胞进行培养，通过脂质体法用pCA1-GFPuv转染乳腺上皮细胞，最后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况以检测乳腺特异性启动子活性与组织特异性．[第一段]     

兔角膜上皮细胞培养后增殖能力的观察

目的:了解培养的兔角膜缘上皮细胞在原代及第2代细胞汇合时的增殖能力。方法:选健康新西兰白兔7只,显微镜下手术切取左眼上方少量角膜缘组织,采用组织块法分别进行培养,在原代上皮细胞汇合传代时(6鄄8d)和第2代细胞汇合时(10鄄12d),用流式细胞仪(FCM)检测样本的细胞周期和凋亡细胞。结果:培养的原代及第2代上皮细胞汇合时平均的增殖指数(PI)为19.1%和9.8%,凋亡细胞比例分别为0.57%和0.37%,处于增殖期细胞的比例在减少,而凋亡细胞的比例一直较低。结论:组织块法适合兔角膜缘上皮细胞培养,并且原代培养的兔角膜缘上皮细胞比第2代细胞具有更强的增殖能力,更适合进行细胞移植。     

建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株

[目的]为探索XIAP相关因子1(Xaf1)调节肿瘤细胞凋亡的机制,利用基因开关调节系统(Teton),拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株.[方法]将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达rtTA的Saos-2细胞中.经过hygromycin的抗性筛选,挑出并扩增表达Xaf1的细胞株.在8例实验组中加入doxycycline,和不加doxycycline的8例对照组比较,重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控.Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示.[结果]在30个抗hygromycin的细胞株中,免疫印迹法筛选出5个明显由doxycycline调控诱导表达Xaf1的细胞株,免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内.流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡,凋亡率最高约20%,而且不影响细胞周期.[结论]Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型;Xaf1是一种核蛋白,能独立诱导肿瘤细胞凋亡.     

cyclin D1,PCNA及p16基因在膀胱移行上皮细胞癌中的表达及其意义

[目的 ]探讨周期蛋白D 1(cyclinD 1)、增殖性细胞核抗原 (PCNA)及 p16基因在膀胱移行上皮细胞癌中的表达及其意义 .[方法 ]采用免疫组织化学S P染色法研究cyclinD 1,PCNA及p 16基因在6 2例膀胱移行上皮细胞癌中的表达 .[结果 ]在 6 2例膀胱移行上皮细胞癌中cyclinD 1,PCNA及p 16基因的阳性表达率分别为 6 5 % ,73% ,4 2 % ,与正常膀胱移行上皮中的表达率相比较有显著性差异 .在膀胱移行上皮细胞癌的不同病理分级中cyclinD 1,PCNA及 p 16基因的阳性表达率分别示 ,G 1级为4 0 % ,35 % ,70 % ;G 2级为 70 % ,88% ,30 % ;G 3级为 10 0 % ,10 0 % ,2 2 % ;各病理分级之间均有显著性差异 .在不同的临床分期 ,3者的阳性表达率分别示 ,Tis～T1期为 5 4 % ,6 3% ,5 0 % ,T2 ～T4期为 93% ,10 0 % ,19% ,不同的临床分期之间均有显著性差异 .[结论 ]cyclinD 1、PCNA及 p 16基因等多种基因的异常表达可能与人类膀胱移行上皮细胞癌的发生、发展及预后有密切关系 .     

细胞角蛋白多肽在毛丝鼠中耳上皮细胞的表达

[目的 ]确认已培育的毛丝鼠中耳上皮细胞株 (CMEC 1)细胞所能表达的细胞角蛋白多肽 .[方法 ]利用免疫细胞化学原理和间接免疫荧光技术 ,将 13种细胞角蛋白抗体试剂反应于培育2 5代的毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞和初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞 ,再与附有荧光素的山羊抗鼠IgG反应 .用荧光显微镜观察 .[结果 ]上述两种细胞与细胞角蛋白抗体 6B10 ,CY 90 ,LDS 6 8,C 11,K8.13和细胞角蛋白抗体C 11,PCK 2 6 ,CY 90 ,KS1A3,M 2 0和A53 B/A2的混合液呈阳性反应 .但与细胞角蛋白抗体CKB1,CK E3,K4 .6 2 ,PCK 2 6 ,K8.12 ,K8.6 0 ,M 2 0呈阴性反应 .[结论 ]毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞与初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞均表达细胞角蛋白多肽 4 ,7和 18.     

缝隙连接蛋白43在经穴上皮细胞和成纤维细胞中表达的实验研究

目的 研究大鼠上皮细胞和成纤维细胞中缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)的表达情况，以深入探索Cx43在细胞缝隙连接通讯(GJIC)及经络循经感传中的作用。方法将大鼠上皮细胞和成纤维细胞联合培养，运用免疫组织化学法、间接免疫荧光细胞化学法和激光共聚焦扫描显微镜(LCSM，Lcica TCS SPI)进行Cx43的定位测定，采用流式细胞仪检测细胞膜上Cx43的表达量。结果 免疫组织化学法和间接免疫荧光细胞化学法显示Cx43在共培养细胞的细胞膜上和胞浆中表达。流式细胞仪检测结果显示在上皮细胞和成纤维细胞膜上Cx43的表达量分别为13．91％和29．53％。结论 Cx43可能是大鼠上皮细胞和成纤维细胞中维持细胞缝隙连接通讯功能和经络循经感传特异表达的连接蛋白。