端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后，观察细胞形态变化，检测细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端合成，从而抑制胃癌细胞的增殖。     

反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其应用研究进展

硫代磷酸酯寡聚核苷酸(PS-ODN)是一类颇有应用前景的反义核酸,本文结合最新研究进展,就PS-ODN作为反义药物所需具备的条件和在抗病毒、抗肿瘤及遗传学分析和分子生物学研究中的应用作了较为详尽的论述。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡模型构建的研究

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与胃癌细胞株共同孵育一定时间后,观察细胞形态变化,观察细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡,染色质固缩,核碎裂,凋亡及小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在D1期前出现亚2倍体凋亡峰;端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡取脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒合成,从而抑制胃癌细胞的生长。     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。同时发现由于bcl-2的ASON作用使HL-60细胞的     

氧化铁磁性纳米颗粒作为MDR1反义寡聚核苷酸载体的构建

目的:构建磁性纳米MDR1反义探针,评价以氧化铁磁性纳米颗粒作为载体转染MDR1反义基因的可行性.方法:应用多聚赖氨酸修饰葡聚糖包裹氧化铁纳米颗粒(dextran coated iron oxide nanoparticles),并将此复合物与肿瘤多药耐药反义基因结合.采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合MDR1反义基因的能力,结合氧化铁纳米颗粒作为载体进行荧光标记的反义寡聚脱氧核苷酸(asODN)体外细胞转染实验.结果:琼脂糖凝胶电泳显示纳米氧化铁在不同的pH值及各种质量比均有良好的DNA结合能力.纳米氧化铁可作为基因载体将MDR1反义基因转染细胞,荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞,普鲁士蓝铁染色观察到细胞内的蓝色铁颗粒.结论:成功构建了MDR1反义基因磁性纳米颗粒.纳米氧化铁可作为基因载体转染人细胞.     

鞘内注射IRF8反义寡核苷酸对CCI模型大鼠痛阈的影响

目的:探讨鞘内注射小胶质细胞干扰素调节因子8(interferon regulatory factor 8,IRF8)反义寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对大鼠慢性坐骨神经缩窄损伤(chronic constriction injury of sciatic nerve,CCI)模型疼痛行为的影响。方法:雄性SD大鼠40只随机分为4组:Sham组、AS组、MM组、NS组,每组10只。除Sham组外,其他三组均鞘内置管并制备CCI模型,AS组、MM组、NS组依次于CCI后12 h鞘内注射IRF8反义/错义ODN、等体积生理盐水,1次/d,连续6 d。制模前测量各组大鼠的基础阈值,制模后1、3、5、7、10、12、14 d对大鼠进行疼痛行为测定。制模后7、14 d western blot检测IRF8、离子钙接合蛋白Iba1表达。结果:与Sham组比较,NS组、MM组大鼠神经损伤后右后爪机械痛阈和热痛阈均显著降低(P<0.05),脊髓IRF8、Iba1蛋白表达显著增强(P<0.05)。AS组于CCI后第10 d起右足机械痛阈和热痛阈下降,但仍高于MM组、NS组(P<0.05)。CCI后第7、14 d IRF8、Iba1蛋白表达,AS组较MM组、NS组显著减弱(P<0.05),但仍强于Sham组(P<0.05)。AS组第14 d IRF8、Iba1蛋白表达较第7 d增强(P<0.05)。结论:经鞘内注射IRF8反义寡核苷酸可抑制脊髓内IRF8表达和小胶质细胞活化而缓解CCI大鼠神经病理性疼痛。     

造血细胞对寡聚核苷酸的摄取

本文以人类骨髓细胞为研究对象,采用短期孵育,单克隆抗体标记和流式细胞仪分析方法,观察了细胞对寡聚核苷酸的摄取。发现骨髓中的各种细胞摄取寡聚核苷酸的能力不同。增殖旺盛的CD33~ 粒-单系祖细胞的摄取率高达89.4±3.0％,包括干细胞和部分祖细胞在内的CD34~ 细胞群摄取率为47.7±7.2％。淋巴细胞对寡聚核苷酸的摄取显示高度异质性,以静止的成熟B细胞群摄取率较高。进一步分析发现成熟B细胞表面多有核苷酸受体,与其寡聚核苷酸摄取率相关。研究结果证明人类骨髓细胞通过多种机制摄取寡聚核苷酸。     

氯胺酮对脊神经结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响

目的：观察腹腔注射氯胺酮（KET）对脊神经结扎（SNL）大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响.方法：雄性SD大鼠42只随机分为五组：SHAM组;KET0组和NS0组结扎后分别腹腔注射KET 10mg/kg和生理盐水（NS）10 ml/kg;KET7组和NS7组,结扎7天后分别腹腔注射KET 10 mg/kg和NS.每组（除SHAM组）给药,每天两次,共7天.结扎后第4、7、14、21、28天行机械性痛敏实验,并用组化方法测定右侧脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞的变化.结果：与SHAM比较,KET0、NS0组机械痛敏试验的压力阈值（PWPT）下降,二者GFAP阳性细胞染色较SHAM深,GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别增加45.0%（P＜0.01）和86.7%（P＜0.01）;与NS7比较,KET7组PWPT升高,KET7组GFAP阳性细胞染色较NS7组浅,相对面积（不同时段）分别下降40.3%（P＜0.01）和24.6%（P＜0.01）.结论：低剂量的KET能抑制星形胶质细胞的激活,从而起到治疗神经病理性疼痛的作用.     

吗啡联合加巴喷丁对术后持续性痛大鼠脊髓小胶质细胞的影响

目的:观察鞘内注射吗啡联合加巴喷丁对皮肤/肌肉切口和牵拉(skin/muscle incision and retraction,SMIR)术后持续性痛大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响。方法:选择鞘内置管成功的雄性SD大鼠120只,随机分为5组(n=24):假手术组、术后持续性痛组、吗啡组、加巴喷丁组和吗啡联合加巴喷丁组。按Flatters法制作大鼠SMIR术后持续性痛模型;应用机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)评定大鼠的疼痛行为学;应用免疫荧光技术检测脊髓背角活化的小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)的表达。结果:与假手术组比较,术后持续性痛组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显下降(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显增加(P<0.05);与术后持续性痛组比较,吗啡组和加巴喷丁组的MWT和脊髓背角Iba-1的表达无明显变化;与术后持续性痛,吗啡组和加巴喷丁组比较,吗啡联合加巴喷丁组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显增加(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显减少(P<0.05)。结论:吗啡联合加巴喷丁对大鼠SMIR术后持续性痛有镇痛作用,可能与抑制脊髓背角小胶质细胞的活化有关。     

氟吡汀对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及其机制研究

目的:探讨钾离子通道开放剂氟吡汀对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及交感芽生的影响,为神经病理性疼痛药物治疗提供理论依据。方法:成年雄性SD大鼠18只,体重250³50 g,按随机数字表法随机分为3组,每组6只:假手术组(S组),对照组(C组),氟吡汀组(F组)。S组大鼠暴露腰5(L5)脊神经,但不结扎。其余组大鼠暴露L5脊神经并结扎,建立疼痛模型。S组和C组大鼠腹腔注射生理盐水2 ml/kg,F组大鼠腹腔注射氟吡汀5 mg/kg,并连续给药7 d。各组大鼠术前3 d及术后1、3、5、7 d检测机械痛阈(paw withdrawal pressure threshold,PWPT)和缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)。术后第7 d,各组大鼠取手术侧L5背根神经节采用免疫荧光染色标记法检测背根神经节内篮状结构变化。结果:与S组比较,C组大鼠PWPT和PWL术后第1 d起显著降低(P<0.05),维持至术后第7 d。与C组比较,F组大鼠术后第3 d起PWPT和PWL明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与C组比较,经过氟吡汀治疗后,F组大鼠术后第7 d手术侧L5背根神经节内篮状结构显著减少(P<0.05)。结论:氟吡汀通过抑制背根神经节内交感芽生以减轻神经病理性疼痛。     

氯胺酮对神经病理性疼痛大鼠脊髓P2X_4受体mRNA表达的影响

目的:研究氯胺酮对神经病理性疼痛大鼠脊髓P2X_4受体mRNA表达的影响.方法:雄性SD大鼠45只,体重180～220g,随机分为假手术组(S组)、对照组(C组)和氯胺酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(KⅠ、Ⅱ、Ⅲ组),每组9只.S组大鼠仅分离坐骨神经但不结扎,其余组建立坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型,K Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别于CCI后3d开始至取材点每天腹腔注射氯胺酮5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg;S组和C组注射相同体积的生理盐水.各组大鼠分别于术前1d,术后3d、7d、14d、21d测定大鼠机械性痛觉过敏(MWT)和热痛觉过敏(TWL).各组均分别于CCI术后7d、14d、21d取3只大鼠,测定痛阈后处死,取L_(4～5)脊髓组织,用逆转录PCR(RT-PCR)方法测定P2X_4受体mRNA表达水平.结果:与术前及S组比较,C组、K Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组术后3d开始热痛阈及机械痛阈显著降低(P＜0.05).与C组比较,K Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组术后7d,14d,21d热痛阈及机械痛阈显著升高(P＜0.05).与S组比较,C组、K Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠脊髓P2X_4受体表达在术后7d、14d、21d均显著增加(P＜0.05);与C组大鼠比较,K Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组脊髓P2X_4受体表达明显减少(P＜0.05).结论:腹腔注射氯胺酮可抑制慢性神经痛大鼠痛觉过敏,该作用可能是通过作用于P2X_4受体介导的.     

慢性坐骨神经结扎神经痛大鼠脊髓nNOS阳性神经元的表达

目的:探讨慢性坐骨神经结扎(CCI)神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS阳性神经元的表达。方法:SD大鼠40只,随机分为五组,每组8只,即naive组、sham组、CCI5d组、CCI10d组;CCI15d组;测定各组大鼠机械缩腿阈值(MWT)和热缩腿潜伏期(TWL);同时sham组大鼠在术后5d、CCI各组分别在术后5d、10d、15d断头处死取脊髓腰膨大,采用免疫组化法测定脊髓背角nNOS阳性神经元的表达。结果:CCI大鼠在手术后形成稳定的痛敏,与naive组和sham组大鼠比较有显著差异;naive组大鼠和sham组大鼠脊髓背角仅见少量nNOS阳性神经元的表达,且两组间无统计学意义;CCI各组大鼠脊髓背角nNOS阳性神经元的表达明显增多,与naive组和sham组比较差异显著。结论:慢性坐骨神经结扎(CCI)神经痛大鼠脊髓背角nNOS阳性神经元的表达增加,脊髓背角nNOS可能参与了CCI大鼠神经病理性疼痛的形成。     

鞘内注射新斯的明对手术切口引起的大鼠脊髓背角P物质表达的影响

目的:研究鞘内注射新斯的明对术后疼痛大鼠疼痛行为和脊髓背角P物质表达的影响。方法:采用大鼠切口疼痛模型,用累积疼痛评分法评价疼痛行为及免疫组织化学法观察P物质的表达。结果:手术前和手术后鞘内注射新斯的明均可降低累积疼痛评分。左侧后爪足底切口可增加同侧脊髓背角P物质样免疫反应 (0. 6173±0. 0731,vs0. 3792±0. 0874,P<0. 01),手术前鞘内注射新斯的明可明显抑制P物质表达的增多(0. 3789±0. 0388,P<0. 01),手术后鞘内注射新斯的明作用较弱(0. 4982±0. 0653,P>0. 05)。结论:鞘内注射新斯的明的抗伤害作用可能与抑制脊髓背角P物质表达有关。     

脊神经结扎后慢性病理痛大鼠异位放电的特点分析

目的:研究L5脊神经结扎模型大鼠的L5背根异位放电的特点及其时程变化.方法:以L5脊神经结扎制备大鼠神经病理性痛模型,利用分离背根单纤维细胞外电生理记录异位放电.结果:(1)记录到三类典型的异位放电,即紧张型、簇状及不规律型放电;(2)放电频率随着时间的推移而发生变化,术后24 h达峰值随后逐渐降低;(3)不同类型的异位放电所占比例也随时间而改变,20 h内以紧张型及簇状放电为主,后期则以不规律型放电占绝对多数,术后14 d只记录到不规律型放电;(4)记录到一类高频呈周期性的放电,此类放电很罕见,且仅出现在术后3 d之内.结论:脊神经结扎后,其对应的神经纤维产生大量的不同类型的异位放电,这种放电可能在慢性神经病理性痛的发生发展的早期起着重要作用.     

蛛网膜下腔应用Ro 25-6981对神经病理痛大鼠的镇痛作用及其电生理学机制研究

目的:研究蛛网膜下腔应用Ro 25-6981,一种选择性的NMDA受体NR2B亚基(NR2B)的拮抗剂,对神经病理痛大鼠的镇痛作用及其可能的机制。方法:(1)雄性SD大鼠蛛网膜下腔置管,手术成功后进行L5脊神经结扎(SNL)手术。术后7天用vonFrey纤维丝测定机械痛敏,筛选出造模成功的SNL神经病理痛大鼠,随机分为三组,通过蛛网膜下腔插管分别鞘内给予(i.t.)Ro25-698110.0μg(20μl)、100.0μg(20μl),或等体积的生理盐水作对照。在给药后第30min、60min、90min和120min测定大鼠后爪的50%缩足阈值(PWT)及鞘内给药前后大鼠的运动功能。(2)通过在体细胞外记录的电生理学方法,观察脊髓背表面给予Ro 25-6981100.0μg对大鼠脊髓背角广动力范围(WDR)神经元放电的影响。结果:(1)与生理盐水组相比,鞘内应用Ro 25-698110.0μg对SNL大鼠的50%PWT和机械痛敏翻转百分率(%MPE)没有明显的影响(P>0.05,n=8),而100.0μg却能显著增加SNL大鼠的50%PWT和%MPE,起到明显的镇痛作用(P<0.05,n=8),并且在上述两种剂量下鞘内给药前后,动物的运动功能没有出现显著改变(P>0.05);(2)与生理盐水组相比,脊髓背表面给予Ro 25-6981100.0μg对WDR神经元的Aβ纤维诱发放电没有显著影响(P>0.05,n=6),但是可以显著抑制C纤维诱发放电(P<0.05,n=6)。结论:鞘内应用选择性的NR2B拮抗剂Ro 25-6981100.0μg可以对SNL大鼠产生明显的镇痛作用,而不影响动物的运动功能;这种镇痛作用可能是通过拮抗脊髓背角的NMDA受体NR2B亚基,进而抑制WDR神经元的C纤维诱发放电所产生的。     

损伤大鼠L5脊神经及其前后根对痛行为的影响

目的:观察大鼠腰5脊神经和脊神经根不同部位损伤对诱导神经病理性疼痛的不同作用。方法:采用腰5脊神经结扎加切断(lumbar5 spinal nerve ligation,L5 SNL)、腰5前根切除(lumbar5 ventral rhizotomy,L5 VR)和腰5背根切除(lumbar5 dorsal rhizotomy,L5 DR)诱导大鼠痛觉过敏,结合痛行为学测试观察病理性疼痛的发展过程。结果:(1)L5SNL可引起大鼠病理性疼痛。双侧后肢50%撤足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)和撤足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)于术后1d明显下降,痛觉过敏的症状,在同侧后肢持续了5周,在对侧后肢也保持3周。(2)L5 VR也可诱导大鼠产生病理性疼痛。双侧后肢50%PWT和PWL于术后1d明显降低,并维持到了术后第5周。(3)L5DR没有引起大鼠产生痛觉过敏症状。与术前基础值和假手术组比较,L5DR后50%PWT和PWL均无明显变化。结论:选择性损伤运动纤维和损伤脊神经均能诱导大鼠产生病理性疼痛,但脊神经背根损伤不引起痛觉过敏。