胶体金免疫层析法检测大肠杆菌O157:H7的实验研究

目的:建立一种简单实用的胶体金免疫层析法用于食品样品中大肠杆菌O157:H7的快速筛查.方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒.标记抗E.coli O157:H7单克隆抗体,制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条,并对其特异性、灵敏度和稳定性进行了测试和评价.结果:该试纸条特异性较好,不与其他受试菌株发生交叉反应,检测灵敏度为105 CFU/mL.120份人工污染E.coli O157:H7模拟食品样本增菌后检测,该法检测阳性118份,灵敏度高达98.3%.结论:本实验成功研制了E.coliO157:H7胶体金免疫层析试纸条,该试纸条具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、操作简便等优点,可用于现场大量样品的初筛.     

软海绵酸胶体金免疫检测法的建立与应用

目的 建立并应用软海绵酸(OA)胶体金免疫层析检测法.方法 通过纯化抗OA单抗、制备胶体金、标记单抗、制备胶体金试剂条、样品模拟提取与加标回收检测、贝类染毒提取及检测,建立和优化金标免疫层析法.结果 选择30 nm胶体金颗粒用于单抗标记,金标单抗浓度为200 μg/mL,金标单抗包被量为2.5 μL/cm,二抗包被浓度为1.0 mg/mL,反应时间为3～5 min,对加标贝肉和染毒贝类的检测灵敏度为25 ng/mL.结论 建立了可用于OA检测的胶体金免疫层析检测法,满足规定的贝类OA含量安全阈值,为腹泻性贝毒检测与食品安全检验提供了新的技术方法.     

胶体金免疫层析技术同步检测甲、戊型肝炎病毒IgM抗体的研究

目的 建立胶体金免疫层析(GICA)同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒的IgM抗体的方法。方法 采用胶体金标记鼠抗人IgM单克隆抗体，制成免疫层析测试条。血清中甲、戊型肝炎的特异性抗体与测试条上金标抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动与膜上固相包被的抗原(HAAg、HEAg)、抗体(羊抗鼠IgM)结合形成肉眼可见的红色线条。结果 自制的GICA试条与EIA对比检测血清标本188份，各单项指标IgM—抗HAV、IgM-抗HEV两法总符合率依次为97．9％、98．4％，检测灵敏度可达2ng／ml。结论 用于同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒特异性抗体的GICA试条的制备条件已基本建立；其检测结果特异性强、灵敏度高、操作方法简便快捷且无需特殊仪器设备。     

检测肌红蛋白的半定量金免疫层析法的研究

目的建立一种半定量检测人血清肌红蛋白的金免疫层析方法,用于急性心肌梗死的快速检测。方法一株抗人肌红蛋白单克隆抗体标记胶体金,另一株抗人肌红蛋白单克隆抗体包被膜作为检测线,兔抗鼠IgG抗体包被膜作为对照线,建立半定量金免疫层析测定方法。结果本法测定结果分为3个半定量判定区段：〈70、70-150和〉150μg/L;与化学发光免疫测定对照检测83份血清标本,符合性良好。结论金免疫层析测定法具有半定量的特点,方法简便、快速、准确,适用于急性心肌梗死的早期检测。     

鼠疫F1抗体胶体金检测试剂的研制和现场评价

目的 为建立鼠疫诊断和监测所需的快速检测F1抗体水平的方法,研制并评价金标检测试剂.方法 胶体金标记和实验室检测,14个省17个监测点现场监测中检测了动物和人的血清样本4789份.结果 金标检测试剂特异性强,敏感性、稳定性好,现场检测结果与间接血凝方法无差异.结论 鼠疫F1抗体胶体金检测试剂可以用于鼠疫病例诊断和动物监测.     

胶体金免疫层析技术同步检测甲、戊型肝炎病毒IgG抗体的研究

[目的]探索并建立胶体金免疫层析(GICA)同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒的IgG抗体的方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记鼠抗人IgG单克隆抗体，制成免疫层析测试条。血清中甲、戊型肝炎的特异性IgG抗体与测试条上金标抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动与膜上固相包被的抗原(HAAg、HEAg)、抗体(羊抗鼠IgG)结合形成肉眼可见的红色线条。[结果]自制的GICA试条与EIA对比检测血清标本188份，各单项指标抗-HAV IgG、抗-HEV IgG两法总符合率分别为98．9％、98．9％，检测灵敏度可达1ng／ml。[结论]用于同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒特异性IgG抗体的GICA试条的制备条件已基本建立；其检测结果特异性强、灵敏度高、操作方法简便、快捷，无需特殊仪器设备，有广泛的应用价值。     

幽门螺杆菌IgG抗体免疫层析分型方法的建立

目的建立1种检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp)抗体的胶体金免疫层析(GICA)方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记SPA,将Hp重组抗原VacA、CagA和UreaA、UreaB抗原包被于硝酸纤维素膜NC上,制成免疫层析检测试纸条.血清中的抗Hp抗体与测试条上金标记物结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的酒红色线条。结果用GICA与免疫印迹试剂盒对比检测了180份血清标本中抗Hp抗体,显示本方法检测敏感度、特异度分别为95.4%和96.3%,两法总符合率为96.1%。结论用这种免疫层析GICA分型方法检测血清中抗Hp抗体,灵敏度高、特异性强、简便快速,有着广泛临床应用前景。     

胶体金免疫结合试验在检验医学中的应用

胶体金免疫结合试验是在酶免疫结合试验的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其特点是单份测定、简单、快速、除商品试剂外不需任何仪器设备 ,几分钟即可用肉眼观察结果。目前已在临床检测中获得广泛应用。现就其检测原理、试剂制作及应用现状和展望作一介绍。一、胶体金免疫结合试验的检测原理胶体金免疫结合试验的检测原理是以微孔滤膜为载体 ,包被已知抗原或抗体 ,加入待检标本后 ,经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合 ,再通过胶体金结合物达到检测目的。根据检测装置的不同可分为金免疫渗滤试…     

一种基于光纤倏逝波生物传感器检测单核细胞增生李斯特氏菌方法的建立

目的建立一种应用光纤倏逝波生物传感器快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法用单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体对光纤进行包被,制备检测光纤探针,用纳米量子点对单增李斯特氏菌多克隆抗体进行偶联标记,建立基于光纤倏逝波生物传感器检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。并对其检测的灵敏性及特异性进行了确定,同时通过对人工模拟样品的检测确认该方法检测实际样本的可能性。结果该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度可达30CFU/mL,且具有较强的特异性同其他常见食源性病原菌无交叉反应,可用于实际样品的检测。结论应用该技术检测单核细胞增生李斯特氏菌是一种快速、准确的新方法,具有实际应用价值。     

胶体金标记免疫层析法检测大肠杆菌O157

目的 应用抗大肠杆菌O157(E.coli O157)单克隆抗体,制备一种简便快速的胶体金标记免疫层析(GICA)条用于检测标本中E.coli O157.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗E.coli O157单克隆抗体,以硝酸纤维膜作为抗E.coli O157单克隆抗体的包被载体,制成GICA检测条.标本中E.coli O157与检测条上金标记抗体(Au-Ab)结合后,利用硝酸纤维膜的层析作用移动,与膜上的固相抗体结合形成可见的红色条带.结果 GICA检测条灵敏度可达105 cfu/ml.用GICA检测了1750份不同食品和人畜粪便标本中E.coli O157,GICA检测条阳性份数43份,后经分离培养检出29株大肠杆菌O157;另14份标本经鉴定,其中12份标本可疑为弗劳地枸橼酸杆菌.结论 GICA条检测标本的E.coli O157,特异性较高,不需任何仪器设备,较简便快速,易于判断结果,故可对标本进行快速筛查,适合各级疾控中心和临床检验部门使用.     

多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌

目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本...     

模拟粪便标本中的单增李斯特菌的分离和检测

目的 建立针对粪便标本中单增李斯特菌的分离鉴定方法,评价方法的检测下限,以提高感染人群标本中单增李斯特菌的检出率,了解我国人群中该菌的携带及感染情况。 方法 对模拟人粪便标本进行二次增菌,采用Real-time PCR检测,并同时分离培养获得该病原菌。 结果 当每克模拟粪便标本中含有7 cfu的单增李斯特菌时,经过增菌后的标本用Real-time PCR方法可检测出阳性结果,并能够通过单增李斯特菌的选择培养基分离得到病原菌。 结论 本研究为从粪便标本中分离单增李斯特菌和由单增李斯特菌引起的食物中毒事件的病原学调查提供了技术支持,有利于对我国人群中单增李斯特菌的携带或感染状况进行调查分析。     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。     

Evaluation of an enzyme-linked fluorescent assay for the detection of Listeria monocytogenes from food

The VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO2) method, which is an automated enzyme-linked fluorescent immunoassay (ELFA), was used for rapidly, specifically and sensitively detecting L. monocytogenes in food samples. All 31 L. monocytogenes strains examined gave positive results. The other bacterial species except Salmonella showed completely negative results, but it was suspected that Salmonella spp. had given a false-positive reaction to the assay. As the detectable limit of the assay was 10? cfu/ml in a food suspension, food samples were required to be enriched in order to increase the number of the bacteria to the detectable limit. However, the ELFA was reconfirmed to be applied satisfactorily as a rapid and precise method for the detection of L. monocytogenes in various food samples, even if the culture had to be enriched for 12 h prior to the assay.     

Rapid detection of Listeria monocytogenes by a PCR assay specific for an aminopeptidase

Specific and rapid detection of Listeria monocytogenes is very important with regard to food safety since all other species of Listeria appear to be non-pathogenic to humans. Conventional microbiological detection methods are very time consuming. The polymerase chain reaction (PCR) is one of the most promising techniques for rapid detection of micro-organisms in food products. We have developed a PCR assay, specific for L. monocytogenes, based on the gene encoding an aminopeptidase, which previously has not been described for this species. The L. monocytogenes aminopeptidase shares strong sequence similarity with aminopeptidase C from Streptococcus thermophilous, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, and with a cysteine proteinase from Saccharomyces cerevisiae. Polymerase chain reaction primers were synthesized based on the DNA sequence of the aminopeptidase gene. A 90 bp product was apparent with all L. monocytogenes strains tested but not with other species of Listeria or other bacterial genera. The PCR assay, which is performed directly from whole bacterial cells, does not involve DNA purification and can be conducted in 4 h. It provided positive identification of L. monocytogenes in mixed culture.     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应（PCR）检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素（hly）基因序列和大肠杆菌的O157抗原（rfbE）基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6-8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

Development of a quantitative polymerase chain reaction method using a live bacterium as internal control for the detection of Listeria monocytogenes

A novel real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) assay was developed for rapid and accurate detection of Listeria monocytogenes. In this Q-PCR assay, a computational DNA random shuffling method was used to design an internal amplification control (IAC) sequence, which was the same in length and G + C content to the hly amplicon. This IAC sequence was inserted into the genome of L. monocytogenes to create a mutant strain named L. monocytogenes-IAC. The LM-IAC was used as an internal control during the PCR assay and produced accurate quantification of L. monocytogenes due to similar DNA extraction and amplification efficiencies between LM-IAC strain and wild-type L. monocytogenes. Quantification by this method was over a 5-log linearity range of initial L. monocytogenes with an R(2) value of 0.9997. This PCR method will provide accurate quantification of L. monocytogenes and can be used in the clinic and food assays for diagnostic purposes.     

Activity of daptomycin against Listeria monocytogenes isolates from cerebrospinal fluid

We tested the activity of daptomycin against 76 Listeria monocytogenes isolates from cerebrospinal fluid by broth dilution and Etest methods. For the broth dilution method, the MIC range was 1.0 to 8.0 and the MIC at which 90% of the isolates tested were inhibited (MIC(90)) was 4.0 mg/liter. For the Etest method, the MIC range was 1.0 to 4.0 and the MIC(90) was 4.0 mg/liter. Presently, daptomycin cannot be recommended for the treatment of L. monocytogenes meningitis.     

单增李斯特菌EGD-e基因组的密码子使用分析

目的 以单增李斯特菌EGD-e为研究对象,分析其密码子使用模式及影响因素。 方法 利用Codon W在线工具分析单增李斯特菌EGD-e基因组的密码子使用情况;利用对应分析、ENC绘图(Nc-plot)等推测影响单增李斯特菌EGD-e密码子偏性的因素;利用高表达优越密码子分析法确定单增李斯特菌EGD-e基因组的主要偏爱密码子。 结果 单增李斯特菌EGD-e基因组中G+C含量仅为37%,偏爱使用以U或A结尾的密码子;对应分析显示第1条向量轴与G+C(R=-0.182, P0.01)、CAI(R=-0.740, P0.01)呈显著相关,且与后者的相关程度明显高于前者。 结论 单增李斯特菌EGD-e基因组的密码子使用具有一定的偏性;推测基因的表达水平是影响单增李斯特菌EGD-e基因组密码子使用的主要因素。同时,基因组密码子使用偏性还受到碱基组成的影响,而基因长度对密码子的使用偏性影响不大。最后确定了UUC、UUA等27个密码子为单增李斯特菌EGD-e的最优密码子。这些结果将为进一步研究单增李斯特菌的基因组学提供基础。