听力学

20 0 4 0 82 0豚鼠耳蜗单离Hensen细胞钾电流特性及三磷酸腺苷对其影响 /李建雄… / /中华耳鼻咽喉科杂志 2 0 0 3;38(5 ) 343～ 346目的 :研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性以及三磷酸腺苷 (ATP)对Hensen细胞电生理特性的影响。方法 :采用传统全细胞膜片钳技术 ,对单离Hensen细胞进行记录。ATP通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。结果 :Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性 ,只有延迟整流性钾电流 (delayedrectificationpotassiumcurrent ,IK) ,没有瞬间外向性钾电流 (transientoutwordpotassiumcur rent ,IA)…     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞钾电流特性及三磷酸腺苷对其影响

目的　研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性以及三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate ,ATP)对Hensen细胞电生理特性的影响。 方法　采用传统全细胞膜片钳技术 ,对单离Hensen细胞进行记录。ATP通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。结果　Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性 ,只有延迟整流性钾电流 (delayedrectificationpotassiumcurrent,IK) ,没有瞬间外向性钾电流 (transientoutwardpotassiumcurrent ,IA)。低浓度 ( 0 1 μmol/L ,1 μmol/L ,1 0μmol/L)ATP可以使Hensen细胞的钾电流的幅度明显降低 ,且呈浓度依赖性 ,浓度越高 ,降幅越大。高浓度ATP( 1 0 0 μmol/L ,1mmol/L ,1 0mmol/L)可以引起Hensen细胞的内向离子流 ,呈浓度依赖性 ,浓度越高 ,升幅越大。ATP的这两种作用均可被ATP受体拮抗剂 ( 1 0 0 μmol/L舒拉明 )所逆转。结论对Hensen细胞不同电压的刺激可以诱发出延迟整流性钾电流 ,低浓度ATP对Hensen细胞的钾电流有明显抑制作用 ,且呈浓度依赖性。高浓度ATP可以引起Hensen细胞的非选择性内向离子流 ,为钾离子依赖性 ,而且是通过ATP受体起作用     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞钾电流特性及三磷酸腺苷对其影响

目的 研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)对Hensen细胞电生理特性的影响。方法 采用传统全细胞膜片钳技术，对单离Hensen细胞进行记录。ATP通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。结果 Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性，只有延迟整流性钾电流(delayed rectification potassiu mcurrent，IK)，没有瞬间外向性钾电流(transient outward potassium current，IA)。低浓度(0．1μmol/L，1μmol／L，10μmol／L)ATP可以使Hensen细胞的钾电流的幅度明显降低，且呈浓度依赖性，浓度越高，降幅越大。高浓度ATP(100μmol／L，1mmoL／L，10mmol／L)可以引起Hensen细胞的内向离子流，呈浓度依赖性，浓度越高，升幅越大。ATP的这两种作用均可被ATP受体拮抗剂(100μmol／L舒拉明)所逆转。结论 对Hensen细胞不同电压的刺激可以诱发出延迟整流性钾电流，低浓度ATP对Hensen细胞的钾电流有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。高浓度ATP可以引起Hensen细胞的非选择性内向离子流，为钾离子依赖性，而且是通过ATP受体起作用。     

硝苯地平对三磷酸腺苷引起的Hensen细胞内向性离子流的抑制作用

目的探讨硝苯地平对高浓度三磷酸腺苷（ATP）引起的豚鼠耳蜗单离Hensen细胞非选择性内向性离子流的影响。方法采用酶消化和机械分离的方法单离豚鼠耳蜗Hensen细胞，选择胞膜清晰、胞质透明的单离细胞通过压力注射仪分别给予0．1mmol／LATP、1mmol／LATP、10mmol／LATP、0．1mmol／LATP＋0．1mmol／L舒拉明、单独细胞外液、140mmol／LCsCl＋1mmol／LATP、40mmol／L四乙基铵（tetraethylammonium，TEA）＋1mmol／LATP、1mmol／LATP＋10μmol／L硝苯地平，并行全细胞膜片钳记录。结果当分别给予Hensen细胞0．1mmol／L（n=10），1mmol／L（n=10），10mmol／L（n=6）的ATP刺激时，均可记录到内向电流，并随ATP浓度的增加而增强，呈现浓度依赖性。该内向电流可被0．1mmol／L舒拉明（n=5），140mmol／LCsCl（n=5）和40mmol／LTEA（n=5）所抑制。单独给予细胞外液刺激后未见内向及外向离子流。当同时给予1mmol／LATP和10μmol／L硝苯地平刺激时，内向性电流消失，转而出现外向性电流。结论高浓度ATP可引起Hensen细胞的内向性电流，此电流与钾通道密切相关，并无机械转化通道参与，硝苯地平可抑制这种内向性电流并出现与正常情况相似的外向性电流。提示硝苯地平可通过Hensen细胞改善钾离子循环，起到部分保护耳蜗功能的作用。     

豚鼠耳蜗部分外支持细胞的分离法

目的 :探讨豚鼠耳蜗部分外支持细胞 (Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞 )的分离方法 ,并建立细胞活性的鉴别标准。方法 :选取健康杂色豚鼠 5只 ,解剖出耳蜗基底膜 ,采用酶解加机械吹打法分离Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞。结果 :可以获得较多数量、活性良好、长短不一的Deiter细胞和Hensen细胞 ,8h内细胞活性较好 ;但外柱细胞数量较少 ,存活时间较短。评价Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性标准 :①细胞膜无膨胀或扭曲 ;②细胞核无肿胀、移位 ;③在相差显微镜下细胞呈半透明状态 ,存在双折射现象 ;④细胞内无呈布朗运动的颗粒。结论 :熟悉耳蜗的解剖特性、分离出完整的基底膜 ,增加酶的浓度和加大机械吹打力度是获取活性良好的Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的关键 ;评价外毛细胞活性的 4项标准同样可用于判断Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性     

豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定

目的：建立豚鼠柯替氏器支持细胞的分离方法，并观察活性支持细胞的形态特征。方法：对豚鼠基底膜用Ⅳ型胶原酶(1mg/ml)消化和微机械分离法获得柯替氏器单离支持细胞，在倒置显微镜下观察细胞的活性和形态特征并记数。结果：不同支持细胞在倒置显微镜下各有其形态特征，第一、二排Deiters细胞为逗点状，第三排为弓状：Hensen细胞为长圆形，半透明的胞质内含有数个脂质样颗粒；外柱细胞呈哑铃状，两端对称性圆球形，中间可见清晰的微管；内柱细胞呈“长勺形”，底部为圆球状，顶部逐渐向外侧弯曲成杯口样结构。每个豚鼠耳蜗可分离出单离Dieters细胞1～4个，Hensen细胞10～20个，内柱细胞和外柱细胞分别约80～100个。结论：Ⅳ型胶原酶消化和微机械分离法可分离出豚鼠柯替氏器的Deiters细胞、Hensen细胞和内、外柱细胞，可为在细胞和分子水平对单离活性支持细胞进行形态和功能变化的研究提供一种简便实用的方法。     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的 观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶(linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞(支持细胞)总钾电流的影响，初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流，并观察100μmol／L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果 在正常细胞外液中，单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K^ current activated at negative potential，IKn)两种钾电流，而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入100μmol／L利诺吡啶后，外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小，IKn被完全抑制；而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论 KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞，其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分，并构成全部的IKn；但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的　观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶 (linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞 (支持细胞 )总钾电流的影响 ,初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法　运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中 8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流 ,并观察 10 0 μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果　在正常细胞外液中 ,单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流 (theK+ currentactivatedatnegativepotential,IKn)两种钾电流 ,而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入 10 0 μmol/L利诺吡啶后 ,外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小 ,IKn被完全抑制 ;而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞 ,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分 ,并构成全部的IKn;但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性

目的：分离豚鼠内耳活性良好的单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞,观察其形态,探讨该细胞的基本电生理特性。方法：采用酶孵育加机械分离法分离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞;利用膜电钳技术在全细胞模式下检举同细胞电容,记录在正常外液中的钾电流,零电流电位,反转电位,并根据相应公式计算离子通道Ｋ与Ｎａ＾＋的相对通透性比率及Ｋ平衡电位（ＥＫ）《结果：单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞多呈逗点状,分为胞体,细柄和指突三部分,核靠近胞体中央,平均     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电生理学特性的研究

目的：应用膜片钳技术记录小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的全细胞电流,了解电压依赖性离子通道的基本电生理学特性,并比较耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异。方法：应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的电极内液及阻断剂,在不同的刺激参数下记录耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的电压依赖性离子通道电流,并进行分析比较。结果：实验记录到了内向的钠电流、延迟整流钾电流、超极化激活内向阳离子通道电流及瞬时外向钾电流,并发现耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的延迟整流钾电流及瞬时外向钾电流的电生理学特性具有显著性差异（P〈0．05）。结论：实验记录到的各种离子电流数据表明耳蜗螺旋神经节细胞具有完成动作电位的形成、传导并对其功能进行调节的离子通道基础;耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异有助于听觉的形成过程。     

Hensen细胞对耳蜗功能的调节

既往人们认为Hensen细胞仅仅起到支撑毛细胞、稳定基底膜结构的作用。新近研究提示,Hensen细胞可以通过释放脂滴增加网状板层和盖膜之间的空间距离,改变毛细胞纤毛与盖膜之间的剪切力,从而调制微音电位(CM);Hensen细胞中脂滴分布从底圈到顶圈逐渐增加,并通过释放脂滴调节基底膜的劲度和质量、以及基底膜不同部位的驻波共振的形成。可见Hensen细胞参与了耳蜗机械调节,增强了耳蜗的敏感性以及感受声音的频率选择性。此外,Hensen细胞还释放ANXA1蛋白参与耳蜗炎症反应、以及可能利用脂滴释放脂肪酸为毛细胞提供营养。本文为研究耳聋发生发展机制提供新线索。     

Survival of Neural Stem Cells in the Cochlea

Adult rat hippocampus-derived neural stem cells (NSCs) have been reported to have been successfully grafted in several brain regions. To evaluate the possibility of treatment of sensorineural hearing loss using NSCs, survival of NSCs in the cochlea was estimated. NSCs were grafted into newborn rat cochleas. Within 2-4 weeks of grafting to the cochlea, some NSCs survived in the cochlear cavity. Some of them had adopted the morphologies and positions of hair cells. This suggests that NSCs can adapt to the environment of the cochlea and gives hope for treatment of the damaged cochlea and sensorineural hearing loss.     

大鼠椭圆囊再生毛细胞前体细胞来源的初步研究

目的 探讨哺乳动物椭圆囊再生毛细胞前体细胞的可能来源.方法 取出生1天的大鼠的椭圆囊,经嗜热菌蛋白酶(thermolysin)处理,消化法进行原代培养.在倒置显微镜下观察椭圆囊感觉上皮细胞(utricular sensory epichelial cell,USEC)的形态、生长特征;透射电镜观察、免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白18、波形蛋白等鉴定USEC上皮细胞来源.免疫细胞化学法、RT-PCR技术检测支持细胞标记物p27k1plmRNA及毛细胞的特征性标记物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Ⅶ a mRNA的表达.结果 原代培养的USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观.可见由数百个USEC包绕液体而成的dome(穹窿样)结构,表达细胞角蛋白,不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其上皮来源.原代培养的USEC表达支持细胞标记物p27k1pl mRNA及毛细胞的特征性标志物Brn3a、Calretinin及AchRa9、MyosinⅦa mRNA,表明培养的USEC可能来源于支持细胞并具有毛细胞的特性.结论 原代培养的USEC能产生毛细胞样细胞且表达支持细胞标记物,表明其来源为支持细胞.椭圆囊感觉上皮的支持细胞可能为毛细胞再生的前体细胞之一.     

Serial Section Reconstruction of the Neural Poles of Hair Cells in the Human Organ Of Corti. I. Inner Hair Cells

Study of the anatomy of the cochlea, and in particular the morphology of synaptic relationships between hair cells and cochlear neurons, is essential for elucidation of the mechanisms of transduction of mechanical acoustic signals into electrical neural events. Because considerable gaps remain in our understanding of the microscopic anatomy of these synapses, particularly in the human, a reconstruction of the neural pole of inner hair cells of the human organ of Corti was performed. The data are based on 526 serial sections from the basal turn (10 mm region) and 356 serial sections from the middle turn (26 mm region). This provided complete data on 3 and partial data on 5 inner hair cells. Afferent terminals on inner hair cells were variable in size, ranging 1 to 20 µm in diameter. Branching of large fibers to produce multiple terminals innervating from 1 to 3 inner hair cells was common. Each inner hair cell received approximately 6 to 8 different nerve terminals. In addition, each terminal possessed a variable number of synaptic contacts. Junctional membrane specialization consisted of synapses, desmosomes, coated vesicles and arrays of microtubules and membrane cisternae. Specialization at synapses consisted of asymmetrical membrane thickening. At inner hair cells the postsynaptic membrane was thicker than the presynaptic membrane. Eighty-three percent of synapses had presynaptic bodies. Vesiculated efferent terminals synapsed on afferent fibers at the base of inner hair cells, but never directly on the inner hair cell. These anatomical data demonstrate distinct differences between the human and animal inner ear, which are important in the interpretation of neurophysiological data in animals and the formulation of hypotheses that involve assumptions crossing species.     

DAPT Enhances the Apoptosis of Human Tongue Carcinoma Cells

Aim To investigate the effect of DAPT （γ-secretase inhibitor） on the growth of human tongue carcinoma cells and to determine the molecular mechanism to enable the potential application of DAPT to the treatment of tongue carcinoma. Methodology Human tongue carcinoma Tca8113 cells were cultured with DAPT. Cell growth was determined using Indigotic Reduction method. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. Real-time PCR and Immuno-Fluorescence （IF） were employed to determine the intracellular expression levels. Results DAPT inhibited the growth of human tongue carcinoma Tca8113 cells by inducing G0-G1 cell cycle arrest and apoptosis, The mRNA levels of Hairy/Enhancer of Split-1 （Hes-1）, a target of Notch activation, were reduced by DAPT in a dose-dependent manner. Coincident with this observation, DAPT induced a dose-dependent promotion of constitutive Caspase-3 in Tca8113 cells. Conclusion DAPT may have a therapeutic value for human tongue carcinoma. Moreover, the effects of DAPT in tumor inhibition may arise partly via the modulation of Notch- 1 and Caspase-3.