乙型肝炎病毒基因疫苗联合抗原蛋白免疫效应的评价

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因疫苗联合乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白(HBsAg)免疫Balb/c小鼠的效应.方法构建编码S蛋白的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗.以HBV基因疫苗联合HBsAg蛋白免疫接种Balb/c小鼠,同时以HBV基因疫苗或S蛋白单独接种Balb/c小鼠作为对照.采用ELISA法检测免疫小鼠的抗HBs应答,3H-TdR掺入法检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应.结果免疫接种2周、4周后,联合免疫组抗HBs滴度高于HBV基因疫苗单独接种组,但低于S蛋白单独接种组;6周后,HBV基因疫苗组抗HBs滴度最高,联合组次之.各组间免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应无显著差异性(P＞0.05).结论 HBV基因疫苗联合S蛋白免疫Balb/c小鼠无优势.     

HBV S基因与HCV C基因嵌合真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含HBV S基因及HCV C基因的嵌合基因真核表达质粒，为HBV和HCV嵌合基因疫苗研究奠定基础。方法：PCR扩增分别获得HBV preS1 preS2、preS2 S、S基因片段及HCV C基因片段，以pcDNA3．1( )为载体，构建同时含HBV preSl preS2 S、preS2 S或S基因与HCV C区基因的嵌合真核表达质粒S1S2SCpcDNA3．1、S2SCpcDNA3．1、SCpcDNA3．1。结果：经酶切鉴定及测序分析，所构建的嵌合表达质粒均连接正确，与预计一致。结论：嵌合基因真核表达质粒的成功构建，将为观察嵌合基因免疫及HBV、HCV基因疫苗的研究提供实验基础。     

HCV重组基因在大肠杆菌中表达及应用

目的；探讨HCV重组基因在大肠肝菌中的表达条件及其表达蛋白抗原在HCV抗体检测中的应用。方法：将含有丙型肝炎病毒E基因、C基因和部分NS基因重组质粒的大肠杆菌以不同方式培养表达，对表达的蛋白抗原进行提取和纯化，并用间接ELISA和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对表达产物进行了初步检定。结果：表达产物中含有特异性的HCV抗原。对40份国家参比阴性血清检测符合率为97．5％，40份阳性参比血清中检出率为92．5％。     

一株新蛋白磷酸酶基因（Sy2）的原核表达载体构建及鉴定

目的用含有人Sy2酪氨酸磷酸酶基因的pOTB7质粒,构建Sy2原核表达重组子,并用该重组子转化原核细胞,表达出含Sy2的融合蛋白,为将来以此融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,进一步研究该基因的功能打好基础。方法用PCR扩增Sy2的PP2C结构域序列,限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pET28a( )中,酶切、测序等鉴定后,重组子pET28a( )-Sy2转染原核细胞,用载体标签His抗体经SDS-PAGE、Western blot方法检测Sy2重组蛋白的表达。结果成功构建出pET28a( )-Sy2重组质粒,Western blot方法检测出融合蛋白的表达。结论成功构建原核表达载体并在原核细胞中表达成包涵体,这种包涵体可以作为抗原制备Sy2的单克隆抗体。     

HCV NS3解旋酶基因原核表达载体pGEX-4T-1的构建

[目的]构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3解旋酶基因原核表达载体,为进一步研究和解析NS3的解旋酶基因对病毒复制的机制准备条件.[方法]将含有NS3基因的pMD-24/HCV NS3质粒转化感受态菌DH-5α并扩增;提取pMD-24/HCV NS3质粒;从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出NS3解旋酶基因;并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与表达载体pGEX-4T-1重组,以得到重组的原核表达载体pGEX-4T-1/NS3解旋酶.[结果]从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出的NS3解旋酶基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列:电泳结果证明已将此片段克隆到pGEX-4T-1内.[结论]成功地构建了HCV NS3解旋酶基因的原核表达载体DGEX-4T-1/NS3解旋酶.     

携带丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的重组腺病毒构建研究

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)的复制缺陷型重组腺病毒,为防治HCV感染的基因免疫和基因治疗提供实验基础. 方法将HCV NS3基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增. 结果通过PCR扩增、酶切、核酸测序及Western杂交法检测鉴定,均证实插入穿梭质粒中的片段为HCV NS3基因(基因型1b);所包装出的复制缺陷型重组腺病毒AdEasy-GFP-NS3具有良好的感染能力,并可在293细胞中表达HCV NS3蛋白. 结论 AdEasy-GFP-NS3携带有HCV NS3基因,能有效地感染293细胞并高效表达,从而为丙型肝炎基因疫苗的进一步研究奠定了基础.     

cblC型甲基丙二酸血症MMACHC基因新突变对小鼠神经细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的作用机制

目的 探讨cblC型甲基丙二酸血症(MMA)致病基因MMACHC新突变,对小鼠神经细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的作用机制。方法 选择2017年5月和7月,江苏省新生儿疾病筛查中心徐州分中心筛查确诊2例cblC型MMA患儿的血液样本中,检出的c.626＿627del及c.228＿231del 2种MMACHC基因新错义突变为研究材料。分析MMACHC基因的2种新突变所累及的氨基酸残基的保守性及预测其致病性后,构建MMACHC基因2种新突变重组质粒,并与野生型MMACHC基因重组质粒,分别瞬时转染小鼠神经细胞(神经元细胞株HT22及神经干细胞株C17.2)进行体外实验。将MMACHC基因c.626＿627del质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元观察1组、神经干观察1组;将MMACHC基因c.228＿231del质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元观察2组、神经干观察2组;将野生型MMACHC基因重组质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元对照组、神经干对照组。采用免疫荧光染色、TUNEL荧光检测及蛋白质印迹法(Wester...     

Pgenesil-1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的质粒构建和鉴定

目的:设计构建Pgenesil－1质粒载体介导的表达ERCClshRNA的重组体质粒.方法:以ERCC1为靶基因,以Pgenesil－1质粒为载体,设计构建重组体,根据ERCCl基因cDNA序列,设计有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,克隆到空载体Pgenesil－1中,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果和目的序列相同,重组体载体构建成功.结论:成功构建了能表达ERCClshRNA的质粒载体Pgenesil－1/ERCC11和Pgenesil－1/ERCC12,为下一步研究ERCC1基因在卵巢癌细胞株顺铂耐药中的作用奠定了实验基础.     

鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

目的克隆鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强蛋白(Microphage infectivity potentiator,Mip)基因,构建原核重组质粒,诱导表达重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。方法提取鹦鹉热衣原体6BC基因组DNA,PCR扩增Mip基因,克隆至p ET-30a(+),构建原核表达载体p ET-30a(+)-Cps Mip。PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导p ET-30a(+)-Cps Mip在E.coli BL21中表达目的蛋白。融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗Mip抗体的效价。结果 PCR扩增得到大小约为768 bp左右的Mip目的片段;经PCR、酶切及测序鉴定,证明构建的原核重组质粒中插入的片段为Cps Mip基因,测序结果经BLAST分析,与Genbank上登录序列完全一致。经IPTG诱导,重组工程菌表达一相对分子量(Mr)约为34 k D的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清效价为1:128 000。结论成功构建了鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体,并表达了相应可溶性蛋白,制备了高效价的鼠抗Mip多克隆抗体。     

HCV、NS5A区部分基因克隆和序列分析

目的 研究输血后肝炎病人的基因型，探讨HCV抵抗IFN疗效的作用机制。方法 以RT－PCR从慢性丙肝病人血清中扩增一段486bp的cDNA片段作目的基因，插入PQE30的多克隆位点，构建重组质粒PQE30－NS5A－1U1D。结果 应用限制酶酶切和测序分析，证实PQE30－NS5A－1U1D中克隆基因是HCVJ的NS5A部分序列，核苷酸和氨基酸序列同源性均在90％以上，包含有干扰素敏感区（ISDR）。结论 血清学抗体检测NS5A片段对HCV诊断有独特的应用价值，有助于抗病毒药物疗效的判定。     

中国莱姆病螺旋体PD91重组OspC的鉴定和抗原性检测

目的 重组中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白C(OspC)并在大肠埃希菌中表达，用于早期莱姆病诊断的研究。方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增出PD91外膜蛋白C基因，定向克隆到表达载体PET-llD，构建重组质粒PET-llD-ospC。用PCR、限制性内切酶分析及序列测定等方法鉴定重组质粒。用Western Blot检测其抗原性。结果 OspC基因被正确克隆到表达载体PET-llD中。序列测定结果证实与国外已报道的序列存在一定的差异。OspC具有强抗原性。结论 该项研究为国内莱姆病的早期特异性诊断的研究奠定了基础。     

Recombinant gonadotropins

Recombinant DNA technology makes it possible to produce large amounts of human gene products for pharmacologic applications, supplanting the need for human tissues. The genes for the alpha and beta subunits of follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), and human chorionic gonadotropin (hCG) have been characterized and cloned. Recombinant FSH (rFSH) has been shown to be safe and effective in the treatment of fertility disorders. In comparison with the urinary gonadotropin products, human menopausal gonadotropins (HMG), and urinary follitropins (uFSH), rFSH is more potent and better tolerated by patients. Recombinant HCG appears to be as efficacious as urinary HCG with the benefit of improved local tolerance. Recombinant LH (rLH) is likely to be recommended as a supplement to rFSH for ovulation induction in hypogonadotropic women. It may also benefit in vitro fertilization patients undergoing controlled ovarian hyperstimulation with rFSH combined with pituitary suppression, with a gonadotropin-releasing hormone agonist or antagonist.     

Recombinant vaccines for poultry

The poultry industry relies on intensive farming to supply meat and eggs at relatively low cost. Many thousands of individuals are reared in enclosed houses which are left vacant for only short times between successive crops. Disease control is essential for the successful raising of poultry and this includes a need for cheap, effective vaccines against the major diseases.     

Frankenstein and Recombinant DNA

Specific and sensitive biochemical techniques can usually establish the diagnosis, and new radiologic techniques aid in tumor localization. These catecholamine-producing tumors must be considered in the differential diagnosis of hypertension, adrenal masses, or episodic sweating, pallor, anxiety, headaches, and palpitations. Surgical resection is curative in most cases.     

两种不同基因型NS3抗原在HCV感染者血清学诊断中的应用

目的 研究两种不同基因型NS3抗原在HCV感染者血清学诊断中的应用价值. 方法 分别用两种不同基因型NS3单片段抗原、两种单片段抗原的混合物(MIX)作为包被抗原,对血清标本进行ELISA测定;应用反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测血清中HCV RNA,数据以X2检验. 结果 85份抗-HCV阳性血清以不同基因型HCV NS3单片段抗原检测,阳性检出分别为52份(Ⅰ型)和50份(Ⅵ型),X2=0.06,P>0.05;100份健康成人体检血清以此两种抗原检测均为阴性;90份抗-HCV阳性血清经MIX抗原检测,阳性检出为65份;51份抗-HCV阳性血清经RT-nPCR检测,29份阳性. 结论 HCV不同基因型NS3编码区抗原片段有不同的抗原反应性,在HCV感染者的血清学诊断中将不同基因型NS3抗原混合使用可能是更好的选择.