Bcr/abl同靶点小干扰RNA与反义寡核苷酸对K562细胞的作用比较

目的比较靶向Bcr／abl基因b3a2融合位点的小干扰RNA（small interferon RNA,SiRNA）及作用靶点完全相同的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人白血病K562细胞的增殖抑制作用,并联用三氧化二砷（As2O3）,比较二者对K562细胞化疗增敏作用。方法体外转录方法合Bcr／abl b3a2融合住点SiRNA,lipofectamine^TM2000转染,改良MTT法检测药物对K562细胞增殖的抑制作用。结果SiRNA和相同作用靶点的ASODN均显示出明显的细胞增殖抑制效应,SiRNA抑制K562细胞的IC50为97．47nmol／L,ASODN抑制K562细胞的IC50为10．71μmol／L;50nmol／L SiRNA与As2O3联用后,明显提高K562细胞对As2O3的敏感性,相同浓度的ASODN对细胞无明显化疗增敏作用。结论本实验结果提示针对Bcr／abl基因融合位点设计的极低浓度的SiRNA即能显著抑制K562细胞增殖,提高细胞对化疗药物的敏感性,其效果明显强于同靶位点的ASODN,显示了RNAi技术应用于慢性髓系白血病的良好前景。     

哌唑嗪对K562白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究α1受体拮抗剂哌唑嗪在体外对K562白血病细胞系增殖及凋亡的影响。方法：采用四唑盐（MTT）比色实验、集落形成实验为指标观察哌唑嗪对K562细胞增殖作用的影响;采用细胞形态学、Hochset33258荧光染色实验、流式细胞术检测细胞凋亡。结果：哌唑嗪能抑制K562细胞的增殖,这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。在5×10-6mol/L哌唑嗪作用下,K562细胞在形态学上可以看见凋亡细胞;流式细胞术也可检测到凋亡峰。结论：哌唑嗪能抑制K562白血病细胞的增殖,并能诱导其凋亡。     

苦参碱对K562细胞增殖及凋亡相关分子表达的影响

目的 研究苦参碱对人白血病细胞K562增殖、凋亡的影响及其机制。方法 苦参碱（0.2mg/ml）作用于K562细胞,每日计数白细胞、计算抑制率;流式细胞分析仪检测苦参碱对K562细胞周期的改变及凋亡的影响;电子显微镜观察凋亡细胞形态;Western blot检测BCL－6及增列细胞核抗原（PCNA）表达情况。结果 苦参碱对K562细胞有明显的抑制作用,用药72h的细胞增殖抑制率达69％;用药5d后,G1期细胞明显增多,高达58.5%,68％的细胞发生凋亡。电子显微镜可观察到苦参碱诱导的早、中、晚期K562凋亡细胞;BCL－6表达增强,PCNA表达下降。结论 苦参碱能显著抑制K562细胞增殖、促进其凋亡,其机制可能与细胞增殖周期受阻及PCNA表达下降、BCL－6表达增加有关。     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

川楝素对K562细胞增殖和凋亡作用的影响

目的：探讨川楝素对人白血病K562细胞增殖和凋亡作用的影响.方法：MTT法检测川楝素对K562细胞和健康成人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的增殖抑制率.瑞氏染色观察川楝素对K562细胞、PBMC形态的影响.透射电镜观察K562细胞超微结构改变.流式细胞术检测细胞凋亡率.琼脂糖凝胶电泳法观察凋亡细胞DNA片段化现象.比色法检测Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性变化.免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-xl,Bax和Fas的表达.结果：川楝素对K562细胞有明显增殖抑制作用,呈时间和浓度依赖性（P〈0.01）,作用72h后IC50值为（52.13±0.82）nmol/L,而对PBMC几乎无影响.普通光镜下分别观察K562细胞和PBMC,K562细胞可见典型的凋亡形态学改变,PBMC形态无明显变化.超微结构显示K562细胞核染色质聚集,固缩,可见凋亡小体;以10,30,50nmol/L川楝素处理细胞72h后,K562细胞早期凋亡率分别为9.66%,26.06%,52.70%（P〈0.01）;琼脂糖凝胶电泳可见典型“梯状”条带;川楝素激活K562细胞Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性;凋亡相关蛋白Bcl-xl表达降低,Bax,Fas表达增强（P〈0.05）.结论：川楝素对K562细胞与PBMC之间具有选择抑制作用和诱导K562细胞凋亡的作用,可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导.     

氯化锂对K562白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究氯化锂(LiCl)在体外对K562白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用液体培养试验，四唑盐(MTT)比色试验，集落培养试验为指标观察LiCl对：K562细胞增殖的影响，采用DNA片段凝胶电泳及细胞形态学改变为指标检测细胞凋亡。结果：①不同浓度的LiCl(10～50mmoL／L)对K562细胞具有抑制增殖的作用，这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②在LiCl(30mmol／L)作用下，K562细胞形态学上可见凋亡细胞，且DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见“梯形带”(DNA ladder)。结论：LiCl能抑制K562白血病细胞增殖和诱导其凋亡。     

川芎嗪对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨川芎嗪对K562细胞端粒酶活性及凋亡的影响,进一步研究川芎嗪抗白血病作用的分子机制。方法：用光学显微镜及透射电镜观察经川芎嗪作用后K562细胞具有的凋亡形态学改变,采用流式细胞仪检测Fas蛋白的表达;采用多聚酶链式反应酶联免疫测定法（PCR—ELIsA）检测白血病细胞端粒酶活性。结果：川芎嗪能抑制K562细胞端粒酶活性,随药物浓度增加和利用时间的延长,其抑制作用增强,并能诱导K562细胞凋亡,使Fas蛋白水平上调。结论：川芎嗪能显著抑制K562细胞端粒酶活性,其作用可能与诱导细胞凋亡有关。在此过程中,Fas也可能参与了细胞凋亡的调节。     

曼宋酮E对白血病 K562 细胞增殖和凋亡的影响

目的观察曼宋酮E对 K562 细胞增殖的影响,探讨其诱导凋亡作用及可能机制。方法台盼蓝拒染实验检测曼宋酮E对 K562 细胞的生长抑制作用;荧光显微镜观察细胞核形态的变化;流式细胞仪测定细胞凋亡率;免疫印迹法测定 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PARP 的活性及 Bcl-2、Bax 和 Bcl-XL 的表达。结果 曼宋酮E抑制 K562 细胞增殖呈时间和浓度相关性;12.5 μg/mL 的曼宋酮E处理 K562 细胞 0、12、24、48 h 细胞凋亡率分别为 (2.1±0.8)%、(3.2±1.6)%、(15.3±8.9)%、(25.1±11.4)%;在曼宋酮E诱导 K562 细胞凋亡过程中,caspase-3 和 caspase-8 以及 PARP 出现活化断裂,casepase-9 表达无明显变化;Bcl-2 家族蛋白 Bcl-2、Bax 和 Bcl-L 表达无显著改变。结论 曼宋酮E可抑制诱导 K562 细胞增殖,并通过 caspase-8 途径介导凋亡     

氯化锂对K562白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 :研究氯化锂 (LiCl)在体外对K5 6 2白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法 :采用液体培养试验 ,四唑盐 (MTT)比色试验 ,集落培养试验为指标观察LiCl对K5 6 2细胞增殖的影响 ,采用DNA片段凝胶电泳及细胞形态学改变为指标检测细胞凋亡。结果 :①不同浓度的LiCl(10～ 5 0mmol/L)对K5 6 2细胞具有抑制增殖的作用 ,这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②在LiCl(30mmol/L)作用下 ,K5 6 2细胞形态学上可见凋亡细胞 ,且DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见“梯形带”(DNAladder)。结论 :LiCl能抑制K5 6 2白血病细胞增殖和诱导其凋亡。     

山茱萸总皂甙对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察山茱萸总皂甙（TSCO）对慢性髓系白血病细胞株K562 增殖的抑制作用.方法 用乙醇溶剂回流法提取TSCO,HPD-100大孔吸附树脂对提取液纯化;用MTT法检测不同浓度TSCO对K562细胞增殖的抑制作用;用Hoechst33342/PI荧光染色法检测细胞凋亡情况;比色法测定凋亡相关蛋白Caspase-3活性.结果 TSCO能够抑制K562细胞的增殖,且随着药物浓度（12.5、25、50、100 和200 μg/ml）增大和培养时间（24 h、48 h和72 h）的延长,对K562细胞活性的抑制作用逐渐增强;不同浓度的TSCO处理72 h后,K562细胞出现典型凋亡的三期形态学改变,可见胞体缩小、核染色质聚集、胞浆浓缩、核固缩、核碎裂,还可见膜包裹的凋亡小体;细胞凋亡率随着药物的浓度的增大而升高;TSCO作用72 h后K562细胞的Caspase-3活性明显增高.结论 TSCO能抑制K562细胞增殖,促进K562细胞凋亡,其作用随着作用时间和药物浓度的增加而增强;TSCO诱导K562细胞凋亡的作用可能与Caspase-3的表达增加有关.     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨桔梗皂甙D（platycodin,PD）与伊马替尼（imatinib,IM）联合用药抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562的作用及机制研究。方法体外培养CML细胞株K562,CCK-8测定PD和IM单药及联合用药对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测AnnexinV/PI标记的细胞凋亡率,Westernblot方法检测cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、PARP、cleavedPARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白表达。结果联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡率较单独用药组效果明显,差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、cleavedPARP蛋白表达,同时下调PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达,差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）。结论PD与IM联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和PI3K/AKT/mTOR信号通路方面明显优于单独用药。     

人参皂甙单体Rh2对K562细胞增殖和凋亡作用的实验研究

目的 研究人参皂甙单体-Rh2(GS-Rh2)对人K562细胞增殖和凋亡作用的影响.方法 采用MTT比色法观察GS-Rh2对体外培养的K562细胞生长的抑制作用;在光学显微镜下观察不同浓度GS-Rh2对K562细胞的凋亡作用及计数凋亡率(AR).结果 MTT比色法测定显示,细胞经GS-Rh2作用后生长受抑制,呈剂量依赖性和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)为25.8 μg/ml.结论 GS-Rh2能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

Bcr—abl特异性系列核酶体外切割活性比较及诱导K562细胞凋亡？…

构建单、双及三单位核酶、鉴定其体外切割活性及对Ｋ５６２生物学特性的影响,探讨核酶用于基因治疗的前景。方法首先针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点设计并合成３个单核酶,耐后通过基因重组构建单、双及三核酶载体,以体外切试验鉴定并比较其活性。     

反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡时Caspase3表达及活性的变化

用反义bcr／abl寡核苷酸片段诱导K562细胞凋亡,观察Caspase3表达及活性变化,以阐明Caspase3在慢性髓性白血病(CML)发病机制中的作用。方法用反义bcr／abl寡核苷酸片段AS和对照无义片段NS处理CML急变细胞系K562,检测细胞凋亡及Caspase3表达和活性的变化。结果K562细胞经AS处理72h,流式细胞仪检测未见亚二倍体细胞增多。原位末端标记法显示AS组24h始出现细胞凋亡增多,72h达高峰,为(78.50＋6.60)％,较对照组(18.21土3.32)％及NS组(24.13土4.17)％明显增多(P     

正常和病理骨髓基质细胞对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究正常和病理骨髓基质细胞（BMSC）在与K562细胞接触和隔离培养条件下对该细胞株增殖与凋亡的影响。方法：将慢性髓细胞白血病（CML）患者和正常人BMSC各自分为单独培养的对照组、K562与BMSC直接接触的接触培养组和隔离培养组，分别于第2、4、7和12d观察K562细胞生长增殖情况；以末端标记技术（TUNEL）检测K562细胞的凋亡。结果：正常BMSC培养条件下与对照组比较，接触培养组和隔离培养组K562细胞数量存培养第4d后显著升高（P〈0．05），接触培养组显著快于隔离培养组（P〈0．05）；在CMLBMSC培养条件下，K562的生长速度显著加快，4d以后与对照组比较的差异有显著性意义（P〈0．01）。K562细胞凋亡在正常BMSC培养条件下显著减少，隔离培养组在第7d、接触培养组在第4d与对照组比较的差异有显著性意义（P〈0．05）；在CMLBMSC培养条件下，隔离培养组在4d后、接触培养组在2d后凋亡减少，与对照组比较差异有非常显著性意义（P〈0．01）。结论：BMSC可通过间接因素（调节因子作用）保护K562细胞，直接接触因素（由黏附分子介导的直接作用）能加强这种保护作用，导致K562细胞生长增快，凋亡减少。     

乙醇诱导人体外培养K562细胞系凋亡的研究

目的：探讨乙醇对人K562细胞的细胞毒作用机制。方法：采用不同浓度乙醇加入体外培养的K562细胞中,用荧光显微镜和倒置光显微镜观察细胞形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳的方法检测细胞DNA裂解。结果：1％乙醇能有效诱导K562细胞凋亡,且随剂量增大凋亡时间缩短。5％乙醇作用30h则可引起细胞坏死。结论：长期饮酒者血液中有核细胞数量减少,可能与其促凋亡作用有关。