小分子酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖凋亡的影响

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法观察AG-490在体外对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖的影响,光学显微镜下观察AG-490对K562细胞形态的变化,流式细胞术检测AG-490对K562细胞凋亡及细胞周期的影响,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR技术检测AG-490作用后K562细胞bcr/abl融合基因及凋亡相关基因c-myc mRNA的表达水平。结果 AG-490可明显抑制K562细胞的增殖,并随药物作用时间的延长和浓度的增加,抑制作用越明显（P〈0.05）;AG-490可使细胞周期阻滞于G1期,促使其凋亡（P〈0.05）。AG-490作用于K562细胞48 h后bcr/abl融合基因的表达无明显改变（P〉0.05）,而c-myc的表达水平明显降低（P〈0.05）。结论 AG-490可能通过阻断JAK2信号通路而下调c-myc的表达,使K562细胞阻滞于G1期,从而抑制K562细胞增殖,促使其凋亡。     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

目的 研究姜黄索衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210bcr/abl信号通路的影响.方法 应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响;应用Western blot法检测P210bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化;比色法测定Caspase-3、Caspase-9活化程度.结果 Fr004对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系,4 μmol/L Fm04作用24 h,抑制率88.4%,半数抑制浓度1.45 μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;Western blot表明Fm04可显著下调P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白,减少细胞线粒体内细胞色素C含量;Fm04处理组Caspase-3、Caspase-9浓度值增加.结论 Fm04显著抑制K562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下调P210bcr/abl下游多种信号分子表达,通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放,最终诱导K562细胞的凋亡.     

川楝素提取物诱导 K562 细胞凋亡的实验研究

目的 探讨川楝素提取物对人白血病 K562 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法 采用 MTT 法检测川楝素提取物对 K562 细胞增殖的影响;Wright′s染色观察细胞的形态学改变;流式细胞技术检测细胞周期与凋亡率的变化;Annexin V/PI 双标记法检测细胞的早期凋亡变化;DNA 琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 片段化;比色法检测 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 相对活性的改变;RT-PCR 检测凋亡相关基因 p21、bcr/abl、H-ras mRNA 表达水平的改变。结果 川楝素提取物显著抑制 K562 细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性,作用 72 h 的 IC50值为 20 nmol/L;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;细胞周期和 Annexin V/PI 双标记检测表明川楝素提取物可诱导 K562 细胞凋亡,并呈剂量-时间依赖性;处理组细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳出现明显的 DNA ladder;处理组细胞 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的活性均显著增加;p21、H-ras mRNA 表达上调,bcr/abl mRNA 表达下调。结论 川楝素提取物对 K562 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与 Caspase 信号途径的活化有关。     

Bcr/abl同靶点小干扰RNA与反义寡核苷酸对K562细胞的作用比较

目的比较靶向Bcr／abl基因b3a2融合位点的小干扰RNA（small interferon RNA,SiRNA）及作用靶点完全相同的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人白血病K562细胞的增殖抑制作用,并联用三氧化二砷（As2O3）,比较二者对K562细胞化疗增敏作用。方法体外转录方法合Bcr／abl b3a2融合住点SiRNA,lipofectamine^TM2000转染,改良MTT法检测药物对K562细胞增殖的抑制作用。结果SiRNA和相同作用靶点的ASODN均显示出明显的细胞增殖抑制效应,SiRNA抑制K562细胞的IC50为97．47nmol／L,ASODN抑制K562细胞的IC50为10．71μmol／L;50nmol／L SiRNA与As2O3联用后,明显提高K562细胞对As2O3的敏感性,相同浓度的ASODN对细胞无明显化疗增敏作用。结论本实验结果提示针对Bcr／abl基因融合位点设计的极低浓度的SiRNA即能显著抑制K562细胞增殖,提高细胞对化疗药物的敏感性,其效果明显强于同靶位点的ASODN,显示了RNAi技术应用于慢性髓系白血病的良好前景。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血病K-562细胞凋亡的实验研究

目的阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法应用细胞形态、DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测,观察HT对K562细胞株的作用方式,进一步用RT-PCR方法研究bcr/abl基因在转录水平的改变。结果0.01～100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡,并呈时间和剂量依赖性。随着药物作用时间的延长,bcr/abl基因的转录下调。结论低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达,诱导K562细胞凋亡。     

WT1基因特异性siRNA对K562细胞表达及增殖的影响

目的:研究WT1基因特异性小干扰RNA (small RNA interference, siRNA)对K562细胞表达及增殖的影响,为白血病的基因治疗提供新的思路.方法:以慢性粒细胞白血病细胞系-K562为研究对象,化学合成并转染针对K562细胞WT1基因的siRNA,倒置显微镜观察细胞的生长状态及形态学改变;MTT法检测细胞增殖状态;半定量RT-PCR检测siRNA对WT1基因表达的抑制作用;流式细胞仪法检测K562细胞凋亡.结果:siRNA转染K562细胞后, 细胞生长受抑,增殖能力减弱,其增殖抑制作用于转染后48、72 h最明显, 增殖抑制率分别为50.6%和54.1%.半定量RT-PCR显示WT1mRNA表达水平明显低于对照组;WT1 siRNA转染48 h后有42.19 %的K562细胞发生凋亡.结论:WT1基因特异性siRNA可显著抑制K562细胞增殖,促进凋亡,为白血病的基因治疗提供了新的思路.     

S-三苯甲基-L-半胱氨酸对慢性粒细胞白血病K562细胞有丝分裂阻滞和凋亡的影响

目的研究S-三苯甲基-L-半胱氨酸（STLC）对慢性粒细胞白血病K562细胞有丝分裂阻滞和凋亡的影响,探讨药物阻滞和凋亡机制及Eg5与bcr/abl信号通路联系。方法将K562细胞分成不加药对照组和不同剂量STLC加药组,药物作用一定时间后,用MTT法检测其对K562细胞的抑制效应,流式细胞术分析细胞周期和亚二倍体峰的变化,Annexin-v/PI双染检测药物处理前后细胞凋亡比率,共聚焦显微镜观察纺锤体与细胞核空间位置关系及凋亡诱导因子（AIF）位移情况,小分子抑制剂阻断结合RT-PCR研究Eg5与bcr/abl信号通路联系。结果STLC可显著抑制K562细胞生长;药物处理早期可阻滞细胞周期进程于G2/M期,且85.5%细胞纺锤体结构呈单星状排列,处理晚期可致细胞凋亡且不依赖于AIF的参与;K562细胞中Eg5表达由bcr/abl酪氨酸激酶所调节。结论STLC诱导K562细胞阻滞在G2/M期并致其凋亡,显示较强的抗有丝分裂和抗肿瘤效果。     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

Genistein 对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响

目的 研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响。方法 用RT－PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡。结果 K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达阳性,用Genistein与K562细胞共同孵育后,bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2／M期,K562细胞出现凋亡。结果 bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,Genistein能使K562细胞生长受抑,诱导其调亡,抑制bcr-abl基因的mRNA表达,并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降,表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血商K—562细胞凋亡的实验研究

目的 阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法 应用细胞形态，DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测，观察HT对K562细胞株的作用方式，进一步用RT-PCR方法研究bc/rlabl基因在转录水平的改变。结果 0.01-100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖性，随着药物作用时间的延长，bcr/abl基因的转录下调。结论 低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达，诱导K562细胞凋亡。     

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的：研究bcr/abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASON）对K562细胞生长的影响。 方法：根据bcr/abl基因类型（b₃/a₂）的cDNA序列分析,以其 mRNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K562细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、³H-TdR掺入率、bcr/abl mRNA和P210蛋白的表达。 结果：3.5～30.0 μmol•L^-1的ASON对K562细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10.0 μmol•L^-1 时抑制作用很小,大于10.0 μmol•L^-1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0.05)。同时发现ASON使细胞的 ³H-TdR掺入率下降, bcr/abl mRNA及P210蛋白的表达下降。结论：ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/abl mRNA转录及P210蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML)细胞有抑制作用。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

Effects of beta-catenin-specific siRNA interference on Jurkat and K562 cells

OBJECTIVE: To inhibit the expression of beta-catenin and investigate the effect of the beta-catenin gene on Jurkat and K562 cells. METHODS: siRNA specifically knocking down the expression of beta-catenin was used to testify the function of beta-catenin in Jurkat and K562 cells. Real time polymerase chain reaction and Western blot were performed respectively to testify the mRNA level and protein level of beta-catenin. Growth curve was determined by counting viable cells using trypan blue refusal-dyed method. The proliferation of cells was assayed by clonogenic counting and MTT method. The apoptotic cells were measured by Annexin V/PI staining. The cell cycle analysis was performed based on propidium iodide staining. RESULTS: Compared with the control group (transfected with siRNA directed against scramble gene), the survival, colonogenicity, and proliferation of the Jurkat and K562 cells were significantly decreased in experimental group transfected with beta-catenin siRNA. The colonogenicity was decreased from 31.9 +/- 5.55 (siRNA) to 25.0 +/- 5.13 (control) in Jurkat cells, and from 47.33 +/- 8.52 (siRNA) to 39.33 +/- 6.26 (control) in K562 cells (both P <0.05). The inhibition rate was (49.3 +/- 9.86)% (siRNA) and (15.1 +/- 6.55)% (control) respectively in Jurkat cells, and (39.4 +/- 7.56)% (siRNA) and (10.1 +/- 6.89)% (control) in K562 cells (both P <0.05). In addition, the apoptotic rate increased from (23.5 +/- 2.82)% (control group) to (55.9 +/- 2.22)% (experiment group) in Jurkat cells and from (14.9 +/- 8.54)% (control group) to (27.9 +/- 15.3)% (experiment group) in K562 cells. However, cell cycle analysis revealed no obvious phases change both in Jurkat and in K562 cells. CONCLUSION: Knock-down of beta-catenin gene may decrease the proliferation, survival, and clonogenicity in Jurkat cells and K562 cells.