鼠艾滋病病毒荧光定量PCR标准品RNA的构建

目的合成构建鼠艾滋病病毒（FLV）荧光定量检测标准品,明确核糖核酸（RNA）标准品体外合成的基本原则。方法通过序列对比,找到FLV最为保守的区段作为RNA标准品的合成目标,进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增,克隆于T载体,测序,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,最后用PCR和电泳检测验证。结果成功合成了FLV荧光定量PCR标准品。结论FLV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则：①选择保守序列;②设计引物时将潜在的终止密码或起始密码排除在PCR目标产物之外;③将启动子（如T7启动子）挂在适当的引物上,保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完的DNA。     

T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定

目的 建立T7RNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统.方法 利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的 基因,构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原.结果 酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原.结论 此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究.     

T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定

目的 建立T7RNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统.方法 利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的 基因,构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原.结果 酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原.结论 此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究.     

三种不同转染方法拯救病毒的比较研究

目的比较3种不同转染方法,探索最佳的拯救病毒策略。方法3种转染方法包括：①含T7RNA聚合酶启动子的全长肠道病毒71（EV71）感染性质粒（P—EV71）和T7RNA聚合酶真核表达质粒（VR-1a）共转染Vero细胞;②含T7RNA聚合酶启动子的EV71全长基因片段（PCR产物）与VR-1a共转染Vero细胞;③利用体外转录技术得到EV71病毒全长RNA,直接转染Vero细胞。分别观察3种方法转染后产生细胞病变效应（CPE）时间及病变情况,用RT—PCR扩增拯救病毒核酸,测序验证其正确性,用蛋白印迹方法检测拯救病毒抗原。结果3种方法均可成功转染Vero细胞得到拯救病毒,三种转染方法转染效果比较：方法③优于②、②优于①。结论三种转染方法均可成功拯救EV71病毒,以病毒RNA直接转染效果最好。     

T7RNA聚合酶/启动子系统在原核和真核细胞表达系统中的应用

T7RNA聚合酶/启动子系统高能效特异地转录mRNA,可用于在原核和真核细胞表达目的基因,具有广阔应用前景。本文综述T7表达系统的构建、应用及其局限性。     

耐核糖核酸酶内含HCV RNA病毒样颗粒的表达

目的 构建可以表达耐核糖核酸酶(RNase)的内含HCV RNA病毒样颗粒的载体质粒。方法 将表达载体pI NCCL用Hind Ⅲ酶切后，与用相同内切酶酶切的HCV RNA非编码区(5′-UTR)扩增产物，在T4 DNA连接酶的存在下连接，构建一新的表达载体pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR，再转化BL21-DE3 E．coli进行原核表达。结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL-HCV RNA5′-UTR，经原核表达为耐RNase的内含HCV RNA病毒样颗粒。结论 得到的pI NCCL-HCV RNA 5′-UTR表达载体及原核表达系统，可作为一个耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台。     

柯萨奇B组病毒VP1胞质表达系统的建立

目的　利用T7RNA聚合酶介导的胞质表达系统增加目的抗原的表达量 ,提高基因疫苗的免疫效果。方法　 (1)构建带有T7启动子、脑心肌炎病毒 (EMCV) 5′非编码区和柯萨奇B组病毒衣壳蛋白VP1的质粒pT7EMCVP1。将该质粒和编码T7RNA酶的pAR 3132共转染HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞 ;(2 )将上述质粒分别转化减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7,让带有不同质粒的两种载体细菌共感染小鼠腹腔巨噬细胞。结果　 (1)经共转染 ,在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中 ,目的抗原VP1在胞质中的表达比单独转染真核表达质粒pcDNA3VP1增加 2～ 4倍 ;(2 )两种质粒载体细菌感染小鼠巨噬细胞后 ,目的抗原VP1也能在细胞中较好表达。结论　pT7EMCVP1和pAR 3132能在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞胞质中表达 ,且表达量比单独转染真核表达质粒pcDNA3VP1明显增加     

T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定

目的建立TTRNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统。方法利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21（DE3）的T7RNA聚合酶基因为目的基因,构建TTRNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原。结果酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT．PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原。结论此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究。     

应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究CSCD

目的 研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）临床病毒株UL/b＆#39;区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列（External guide sequences,EGS）在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.     

脊髓灰质炎病毒的多尿苷酸聚合酶和RNA复制酶具有同样的病毒多肽

脊髓灰质炎病毒的基因组是单链RNA,在感染的细胞质内借助于依赖RNA的RNA聚合酶(复制酶)进行复制。这种复制酶可能会有一种或多种病毒编码的蛋白质,但证据还不充分。作者曾分离到一种可溶性的脊髓灰质炎病毒特异的依赖RNA的RNA聚合酶,多尿苷酸聚合酶,     

真核普通转录因子

三类真核RNA聚合酶分别选择性地转录细胞核基因,其转录特异性并不决定于RNA聚合酶本身,而是取决于被转录基因的启动子元件及能识别并结合这些元件的普通转录因子,它们与RNA聚合酶相互作用,在启动子区组装成转录起始复合物,从而起动转录。已知的三类普通转录因子中,大多数为相应RNA聚合酶所专用,只有少数因子中的个别亚基是三类酶所通用。本文简述这三类普通转录因子的结构、性质及其在转录中的功能。     

人原癌基因c—fos反义RNA制备及初步应用

采用逆转录 DNA 聚合酶链反应方法合成了人原癌基因 c—fos 特定 cDNA 片段.然后,将该片段与 PGEM3Zf( )质粒重组,构建成为可体外转录 c—fos 反义 RNA 重组质粒.选用 T7RNA 聚合酶系统合成了 c—fos 反义 RNA。且本文对反义 RNA 的应用亦进行了初步探讨.     

用于化学和酶合成的治疗性RNA的修饰核苷酸

近年来, RNA被广泛应用于药物和疫苗等的研发之中, RNA在应用研究中遇到的困难可以尝试在合成RNA的过程中加入经过修饰的核苷酸来克服。基于酶合成的方法主要包括体内转录和体外转录, 体内转录可以使用工程支架来促进RNA产物环状化, 提高RNA的稳定性, 相对经济也是其优点之一, 而广泛的下游加工则是该方法的弊端;体外转录是目前RNA合成的最常用的方法, 需要设计携带特异性噬菌体启动子片段(S6、T3、T7)的DNA模板, 以便RNA聚合酶结合和提供转录启始信号, 获得的寡核苷酸长度范围大, 生产成本相对较低, 可重复性强, 但由于3′端存在异质性, 可能导致产物末端不均匀。该方法中, 仅T7 RNA聚合酶可以接受修饰的核苷酸。获得含有核苷酸类似物的短RNA分子的最佳方法是化学合成, 常用的是磷酸酰胺固相合成法, 主要步骤为脱三苯甲基(使用三氯或二氯乙酸溶液去除DMT基团)、缩合反应(游离的5′-羟基与活化的核苷3′-磷酸酰胺反应形成新的核苷酸间键)、加帽(使用乙酸酐/鲁替丁/N-甲基咪唑混合物将游离的5′-OH转化为乙酰酯)、氧化(不稳定的亚磷酸盐-P(III)氧化为P(V)磷酸)。...     

地高辛精标记大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精标记的大鼠代谢型谷氨酸受体第 5亚型 c RNA探针 ,本实验用分子生物学技术重组质粒 p GEMm Glu R5 ,经限制性内切酶酶切分析 ,证实其确有 m Glu R5基因片段插入且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化得到线性DNA片段 ,用 T7RNA聚合酶体外转录合成带有地高辛精标记的高比活性的单链 RNA探针 ;经斑点杂交实验证实该探针具有较高的敏感性和可靠性 ,可用于代谢型谷氨酸受体第 5亚型有关的研究     

乙型脑炎病毒活疫苗生产株SA14-14-2的感染性克隆构建

目的　构建乙型脑炎病毒 (乙脑病毒 )活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆。方法　在对SA1 4 14 2株全长基因组测序基础上 ,引入适当酶切位点和T7RNA聚合酶启动子 ,采用分部连接策略 ,获得全长基因组cDNA ,体外转录RNA后 ,转染细胞获得感染性克隆 ,病毒传代培养、抗体中和试验和乳鼠脑腔攻击试验鉴定病毒。结果　由疫苗株cDNA构建了病毒感染性克隆 ,经鉴定为乙脑病毒 ,且病毒毒力比野毒株弱。结论　获得了乙脑病毒活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆 ,为进一步研究疫苗的减毒机理及开发新一代疫苗奠定了基础     

在哺乳动物细胞中用于表达干扰RNA的启动子

RNA干扰是由双链RNA诱导的特异性转录后基因表达沉默。目前用于在哺乳动物细胞中表达干扰RNA的启动子分为RNA聚合酶Ⅲ类启动子(polⅢ)及RNA聚合酶Ⅱ类启动子(polⅡ)。不同的启动子及经过不同方法改造后的启动子能满足不同研究目的的需要,从而极大地拓展了RNA干扰的应用范围。     

以人类前列腺癌细胞构建全长的cDNA文库的方法

目前使用的构建 c DNA文库的方法要求几千个细胞和较长时间用于逆转录步骤 ,限制性酶切 ,连接头和载体克隆 ,而且常因为丢失稀有 c DNA难以保证所构建文库的完整性。而对体内研究工作来说 ,在多种细胞混杂的组织中研究某一种特定种类细胞的表达情况是很重要的 ,这里我们介绍一种全新的 c DNA文库的构建方法 ,它简便快速 ,几十个细胞就可用来构建完整的 c DNA文库。该法以 5′端偶连 T7RNA多聚酶启动子序列的 Oligo- d T作为引物 ,逆转录反义 RNA,提高了从有限的 c DNA模板上 m RNA转录的拷贝数。为防止 m RNA在操作过程中降解 ,…     

利甩小RNA高通量测序筛查媒介昆虫携带的病原体

高通量测序方法筛查媒介昆虫携带病原体是一种新的重要方法。研究表明小RNA高通量测序可用于昆虫携带病毒的检测。本工作尝试用小RNA高通量测序法筛查昆虫携带的病毒,发现该方法不仅可用于媒介昆虫携带病毒的检测,也可以用于原核和真核病原体的筛查。用该方法对野外采集的3种蚊虫和3种蜱进行分析,用blast程序对NCBI核酸序列库（nt）进行比对搜索,从测序结果中查找到多种病毒、原核及真核的病原体。上述结果表明,小RNA高通量测序可以用于各种病原体的发现,有望发展成为一种通用的病原体筛查技术。     

GII.P16型诺如病毒聚合酶蛋白的原核表达、活性测定和结晶

目的:原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）蛋白,并对其进行生物活性测定和晶体制备。方法:首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体,构建重组表达质粒,然后转化至大肠杆...     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。