碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用,采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取P2代骨髓间充质干细胞,分为3组,正常培养组为对照组,其他2组分别转染重组腺病毒（Ad.bFGF-eGFP）及空病毒（Ad.eGFP）。相差显微镜观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞增殖曲线,ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型;碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组;ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化,增加增殖活力,促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。     

转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面生长状况

背景:颌面骨缺损是临床上常遇到的问题,寻找理想的种子细胞同支架材料复合构建组织工程化人工骨成为该类疾病治疗的发展趋势.目的:将转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞与珊瑚骨的复合培养,观察转染碱性成纤维生长因子基凶的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况.设计、时间及单位:骨组织工程实验,于2006-0312008-06 在中山大学口腔医学研究所完成.材料:选用海南省浅海滩产石头状滨珊瑚为原料,将其制成8mm×8mm×2mm的珊瑚人工骨小块.方法:采用密度梯度离心法分离新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,采用贴壁筛选法对分离出的骨髓间充质下细胞进行纯化,利用脂质体转染bFGF-pcDNA3到骨髓间充质干细胞.取生长良好的转染碱性成纤维生长因子基因骨髓间充质干细胞和未转染的骨髓间充质干细胞,分别接种于不同珊瑚表面.主要观察指标:MTT法观察细胞-支架联合培养骨髓间充质干细胞的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况.结果:MTT法检测显示细胞-支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比差异有显著性意义(P＜0.05),联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞.而联合培养的转染组细胞同单纯培养转染组细胞增殖相比差异无显著性意义(P＞0.05).扫描电镜观察显示复合骨髓间充质干细胞细胞贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,细胞向孔内长入或跨越微孔表面,部分区域有细胞外基质形成.结论:转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响骨髓间充质干细胞的增殖,可以作为骨髓间充质干细胞支架材料构建组织工程骨.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质千细胞后bFGF目的基因的表达情况，并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法：实验于2005—03／2006—02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，构建含bFGF基因的腺病毒表达载体，利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后，将细胞接种12孔培养板，培养至90％融合时弃上清，调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果，以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后，胰酶消化，置于6孔板内，每孔细胞数量5&;#215;10^5，2d后细胞贴壁生长于盖玻片上，分别转染Ad．bFGF、Ad．GFP，同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Westem—Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达，ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果：①pcDNA3／bFGF的鉴定结果：成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad．GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定：转染48h后，绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时，腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关（P〈0．05），当〉200时转染效率趋于稳定，均在96％以上。③Ad．bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况：bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad．bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒，阳性表达率为86％，而转染Ad．GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western—Blot示转染Ad．bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad．GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad．bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng／L，此后逐渐下降，但至转染第28天时仍显著高于空白对照（441ng／L，128ng／L，t=4．31，P〈0．01）。④转染Ad．bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响：骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论：采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景:目前正在兴起的干细胞治疗技术及基因修饰技术有可能在肺动脉高压治疗中获得独特疗效。目的:探讨携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠血流动力学水平的影响。方法:选择3周龄SD雄性大鼠,于体外进行骨髓间充质干细胞培养及纯化,在腺病毒介导下实施基因转染,使碱性成纤维细胞生长因子基因成功导入骨髓间充质干细胞。将60只SD大鼠给予野百合碱腹腔注射(50 mg/kg)进行肺动脉高压模型复制,随机分成3组,其中肺动脉高压组于颈内静脉移植1 m L的L-DMEM培养基,骨髓间充质干细胞组于颈内静脉移植1 m L空腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞悬液,碱性成纤维细胞生长因子组于颈内静脉移植1 m L腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞悬液。结果与结论:经3周治疗后,各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P>0.05);其中碱性成纤维细胞生长因子组大鼠的肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05);各组大鼠右心室的肥大指数比较差异无显著性意义(P>0.05);碱性成纤维细胞生长因子组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示携带碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞移植,能够改善肺动脉高压大鼠肺血管的血流动力学水平,保护机体血管的内皮细胞,并拮抗血管的收缩。     

锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用体外培养骨髓间充质干细胞的生长及增殖

背景:如何简便有效的在体外大量扩增骨髓间充质干细胞,已成为神经科学研究热点.目的:观察锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对骨髓间充质干细胞体外生长及增殖的影响,以寻求体外快速、大量增殖骨髓间充质干细胞的有效方法.方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞.实验分为对照组(不加任何影响因子)、锌组、碱性成纤维细胞生长因子组、锌+碱性成纤维细胞生长因子组,分别用特定浓度的锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用.观察细胞生长曲线,用四唑盐比色法观察存活和增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,进行细胞表面抗原的鉴定.结果与结论:细胞生长曲线、四唑盐比色法、流式细胞仪结果均显示,第3～5天各组增殖能力达高峰,其中锌+碱性成纤维细胞生长因子组增殖能力最强(P<0.05).第7天,对照组及单独应用碱性成纤维细胞生长因子和锌组细胞增殖力均有所下降,仅锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞仍保持较强的增殖(P<0.05).锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中处于S+G2+M期的百分率最大,与其他3组相比差异有显著性意义(P<0.01).结果证实,锌和碱性成纤维因子均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用,联合应用锌和碱性成纤维细胞生长因子促增殖作用最强,可以作为体外扩增培养骨髓基质细胞的最佳培养条件.     

血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞

背景：骨髓间充质干细胞植入机体不同类型组织后可以分化为相应组织的靶细胞，提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向，但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚。目的：检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—03／2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者，无血液系统疾病和家族遗传病史。血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品。方法：无菌条件下取健康人骨髓，采用Ficoll密度梯度离心＋贴壁法分离纯化培养骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞，诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10％胎牛血清的DMEM培养液，对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化，免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达，透射电镜观察细胞超微结构。结果：诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形，呈内皮样细胞形态特征，CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达，细胞胞浆内可见W-P小体。对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性。结论：血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

人脐带Wharton's jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景;培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的.目的:拟采用组织块培养法从人脐带Wharton'sjelly中分离培养问充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响.方法:采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质于细胞,对照组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+20 pg/L碱性成纤维细胞牛长因子培养.观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3 d或4 d更抉培养液,待细胞达到80%～90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1:2或1:3的比例传代.结果与结论:倒置显微镜下观察对照组中从8～10 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6～8 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁.1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同; 3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强.流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR.结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton'sjelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增值能力,并且不改变细胞的表面标志物表达.     

骨髓间充质干细胞的基因转染

1人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达,2011年15卷10期1769页。2体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定,见2010年14卷19期3507页。3碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞,见2009年13卷49期9687页。     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景:研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物.目的:通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤.方法:日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤.观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBIot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构.结果与结论:传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好.细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性.碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤.     

诱导人骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化过程中肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景:骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓内的非造血干细胞,因其具有自我更新能力及多向分化潜能,且分离培养方法成熟,在组织器官修复及再生方面显示出良好的应用前景,将为终末期肝病的治疗如生物人工肝及肝细胞移植提供新的细胞来源,但目前人骨髓间充质干细胞向肝系细胞诱导分化培养体系尚不成熟。目的:观察肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝系细胞分化的可能性。设计:开放性实验。单位:南昌大学第一附属医院传染科与泌尿外科研究所。材料:实验于2004-07/2005-03在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。所用骨髓由成年健康志愿者提供(均对本实验知情同意)。DMEM/F12培养基(Gibco公司);表皮细胞生长因子,肝细胞生长因子,胰岛素,转铁蛋白,鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体,FITC-兔抗鼠IgG(Sig-ma公司);碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen公司);鼠抗人角蛋白18,19单克隆抗体(Chemicon公司);胎牛血清(杭州四季青)。方法:以骨髓腔穿刺方式抽取成年健康志愿者髂后上棘处骨髓10mL,采用密度梯度离心法分离和反复贴壁法纯化骨髓间充质干细胞。取培养至4～8代细胞,消化后以107L-1接种到放置20mm×20mm爬片的预先铺被有0.1%明胶的24孔板中,次日换液,改用无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的表皮细胞生长因子和10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子)培养2d后,换成无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的肝细胞生长因子,10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,5mg/L的胰岛素,5mg/L的转铁蛋白)进行诱导分化,每3d换液1次,以未加入肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞作为对照组。骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,放射免疫荧光法测甲胎蛋白浓度。诱导当天及第7,14,21,28天,取诱导细胞爬片,细胞免疫荧光法检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、角蛋白18和角蛋白19的表达,并进行糖原染色检测诱导细胞的糖原合成情况。主要观察指标:①细胞形态学观察。②培养上清液中甲胎蛋白表达量的测定。③肝细胞表面标志检测结果。④诱导细胞的糖原合成情况。结果:①诱导第14天可观察到细胞变成短梭形和多角形,随培养时间的延长多角形细胞增多,并可形成肝细胞样的细胞集落。②诱导第14天培养上清液内可检测到甲胎蛋白的分泌,每孔浓度为0.1μg/L;第17天达高峰0.4μg/L;第21天下降至0.3μg/L。③诱导第14天甲胎蛋白、角蛋白18表达呈阳性,第28天角蛋白19表达呈阳性。④诱导第21天糖原染色呈阳性反应。结论:肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能够诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝细胞分化,表达肝细胞特异性表面标志,并具有合成糖原、分泌甲胎蛋白的功能。     

载碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释系统与骨髓间充质干细胞的增殖

背景：课题组运用发酵技术开发出了一种新型多聚羟基烷酸——羟基丁酸与羟基辛酸共聚物,不仅具有聚羟基烷酸的通性,而且其柔韧性与加工性能得到较大改善。目的：检测羟基丁酸与羟基辛酸共聚物载碱性成纤维细胞生长因子纳米微球对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。方法：采用W1/O/W2超声乳化法制备羟基丁酸与羟基辛酸共聚物载碱性成纤维细胞生长因子纳米微球,采用全骨髓法培养骨髓间充质干细胞,按照培养液中所含成分不同分为3组：碱性成纤维细胞生长因子组、纳米微球组、对照组,其中前两组碱性成纤维细胞生长因子的有效质量浓度分别设为10,20,50μg/L。结果与结论：共培养第1,3天,碱性成纤维细胞生长因子组与纳米微球组吸光度值比较差异无显著性意义（P〉0.05）,但吸光度值显著高于对照组（P〈0.05）,即碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞具有明显促增殖作用;第5,7天纳米微球组吸光度值高于碱性成纤维细胞生长因子组（P〈0.01）,即纳米微球缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子,明显提高生物利用度;第10天纳米微球组细胞仍然有较强的增殖能力,与其他2组比较差异有显著性意义（P〈0.01）,而此时碱性成纤维细胞生长因子组、对照组间差异已无显著性意义（P〉0.05）。结果说明纳米微球对碱性成纤维细胞生长因子具有良好的缓释作用,能发挥较为持久的生物学效应,可以持续促进骨髓间充质干细胞增殖。     

可吸收性珊瑚羟基磷灰石与人骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞复合培养及碱性成纤维细胞生长因子的作用

目的:观察人骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞与珊瑚羟基磷灰石的相容性及碱性成纤维细胞生长因子的作用。方法:实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室及上海第二医科大学完成。实验材料:①可吸收性珊瑚羟基磷灰石。②人骨髓间充质干细胞:取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者(年龄10～16岁,平均14.5岁),患者均知情同意。实验分组:使用含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的条件培养基诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,与珊瑚羟基磷灰石复合培养,分为实验组(RPMI1640完全培养液 成骨细胞 可吸收性珊瑚羟基磷灰石),促增殖组(完全培养液 成骨细胞 可吸收性珊瑚羟基磷灰石 10μg/L碱性成纤维细胞生长因子),正常培养组(完全培养液 同等数量的成骨细胞)。实验评估:①采用扫描电镜观察成骨细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合培养6h,1,3,7d时细胞形态。②成骨细胞附着于材料表面后生长增殖特性:于接种后24h,各组均取6孔细胞用胰蛋白酶消化贴壁细胞,包括材料上贴附的细胞,计数孔内细胞数及平均细胞数,绘制细胞生长曲线。③成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的测定:于接种后1,3,5,7d采用酶联免疫监测仪测410nm波长的吸光度值,计算每1000个细胞的吸光度值。结果:①成骨细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合培养后细胞形态:复合培养6h,细胞多为单层结构,形态多样,有数个突起;复合培养1d,成骨细胞附着于可吸收性珊瑚羟基磷灰石表面并深入到材料的孔隙内,与材料牢固结合,并在材料表面伸展,细胞表面可见大量微绒毛;复合培养7d,细胞数量增多,可见少量胞体表面及细胞间有颗粒状钙盐结晶沉积,细胞形态无明显差异。②成骨细胞附着于材料表面后生长增殖特性:实验组细胞接种后,随时间延长数量逐渐增加,仍可保持正常的分裂增殖速度,与正常培养组相比差异无显著性意义(P>0.05)。复合培养4,5,6,7d后促增殖组细胞附着载体后数量增长明显高于实验组、正常培养组,差异均有显著性意义(P<0.05)。③成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的测定:随着培养时间的增加,3组细胞碱性磷酸酶含量(每1000个细胞的平均吸光度值)均逐渐增高(以实验组为例,复合培养1,3,5,7d分别为0.0121±0.0014,0.0154±0.0013,0.0172±0.0012,0.0183±0.0015),差异无显著性意义(P>0.05)。结论:①人骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞可以在一定的生物载体上正常生长、增殖,并保持生理功能。②10μg/L碱性成纤维细胞生长因子可促进此过程中细胞增殖。     

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

背景:肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成,已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗.目的:鉴于重组腺病毒的宿主范围广,探讨重组腺病毒介导的入肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、日的蛋白表达及细胞活性的影响.设计、时间及地点:2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验.材料:清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠.方法:向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导.以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞.主要观察指标:油红O染色检测成脂情况.流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达,计算转染效率.EUSA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达,MTT法检测转染脂肪细胞的活性.结果:①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴,成脂率(97.31±0.46)%.②以100 pfu/cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72 h后,绿色荧光蛋白表达量达高峰,此时转染效率为65.39%.③以100 pfu/cell作为最佳感染强度转染脂肪绌胞72 h后,肝细胞生长因子的表达量为峰值.与未转染空白对照比较,转染后24,48,72,96,168 h脂肪细胞活性均无明显变化(t=0.024～0.092,P>0.05).结论:重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞,有效表达目的蛋白,且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响.     

转染癌基因的骨髓基质干细胞体外分化特征

目的:观察转染癌基因的骨髓基质干细胞在体外分化情况,为肝细胞癌的细胞源研究提供实验依据。方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学药理教研室实验室完成。①两步法获取大鼠肝细胞,梯度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞。②单基因转染是单独将c-myc或K-ras癌基因瞬时转染大鼠骨髓基质干细胞,6孔培养板中培养,24h后荧光显微镜下观察骨髓基质干细胞转染结果。双基因转染步骤相同,只是将c-myc和K-ras癌基因同时转染大鼠骨髓基质干细胞。③c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组常规培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养,每24h半量更换培养液。④c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组将已转染癌基因的骨髓基质干细胞,置于叠加的培养板半透膜的上方(细胞密度均为1×105个/cm2),再将肝细胞置于半透膜的下方(每孔细胞密度为3×105/cm2)进行共培养,其余步骤同常规培养。⑤通过反转录聚合酶式反应和细胞免疫组化检测骨髓基质干细胞分化情况。结果:①癌基因转染24h骨髓基质干细胞检测结果:单独转染c-myc或K-ras癌基因的细胞,其绿色荧光蛋白呈均匀一致分布;双基因转染的细胞,绿色荧光蛋白呈点片状分布。②各组骨髓基质干细胞向肿瘤细胞分化检测结果:c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组的骨髓基质干细胞,均未向肿瘤细胞分化;c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞,均向肝细胞癌发展;空白对照组骨髓基质干细胞细胞均为阴性。此外,双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞分化增殖迅速,反转录聚合酶式反应和免疫组化检测发现,培养第7天出现甲胎蛋白表达,并迅速增加,而第7天出现的白蛋白和细胞角蛋白18表达迅速减弱,第14天消失。结论:转染癌基因的骨髓基质干细胞,在向肝细胞诱导的条件下,部分癌基因可以使干细胞分化为肝癌细胞;多癌基因转染时,更易于使干细胞分化为肝癌细胞。