超抗原SEB或SEC对T细胞分泌IL-2和杀伤 HcaF 细胞的影响

目的探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)在体外刺激T细胞分泌IL-2和杀伤肿瘤细胞的作用。方法不同浓度SEB或SEC在体外刺激T细胞,采用流式细胞术检测T细胞受刺激后不同时间分泌IL-2的水平,用MTT法检测活化的T细胞及其上清对肝细胞癌HcaF细胞的杀伤效应。结果SEB或SEC能刺激T细胞大量分泌IL-2,刺激剂量以100μg/L时活化T细胞的能力最强,最佳刺激时间为3～4d。SEB或SEC活化的T细胞对肝细胞癌HcaF细胞具有很强的杀伤效应,两者对T细胞分泌IL-2和杀伤HcaF细胞的作用无明显差异。结论SEB或SEC具有很强的刺激T细胞分泌和增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力,为其应用于肿瘤免疫治疗奠定了一定基础。     

超抗原和肿瘤抗原修饰树突状细胞的杀瘤效应

目的:测定经超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B (SEB)和结肠癌肿瘤抗原联合修饰树突状细胞(DC)的活性.方法:结肠癌手术标本体外培养出结肠癌细胞并鉴定之,冻融法制备肿瘤抗原;同一患者外周血分离出单个核细胞,以细胞因子诱导为DC;尼龙棉柱过滤获取T淋巴细胞;肿瘤抗原和不同质量浓度的SEB联合修饰DC;以联合抗原修饰后的DC为刺激细胞,自体T淋巴细胞为效应细胞,相同时间下以不同比例共同孵育后,采用MTT法检测对结肠癌细胞的体外杀伤效果.结果:诱导出表达CD11c,CD80,HLA-DR分子的DC,经结肠癌肿瘤抗原和SEB联合修饰后,上述分子表达上调.联合抗原修饰DC的T细胞活化作用强于单独使用结肠癌肿瘤抗原修饰DC的T细胞活化作用.100 μg/L SEB 和肿瘤抗原联合修饰的DC以1GA6FA100比例与T淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强.结论:SEB和肿瘤抗原联合修饰DC的活性明显强于单用肿瘤抗原修饰DC的活性.     

超抗原和肿瘤抗原修饰树突状细胞的活性研究

目的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和肿瘤抗原修饰树突状细胞(dendritic cell,DC)后,活化的DC与淋巴细胞(lymphocyte cells,LC)共孵,观察DC激活的LC在体外对结肠癌细胞的排斥性杀伤作用,以评价抗原修饰的DC活性。方法外周血分离出LC、单个核细胞,细胞因子诱导DC扩增,DC活化LC,对同种异型肿瘤细胞排斥性杀伤实验。结果SEB 肿瘤抗原修饰后的DC具有显著的淋巴细胞活化作用。加SEB比单独使用肿瘤抗原修饰DC后的活化淋巴细胞的功能强(P<0.05)。结论SEB和肿瘤抗原联合修饰可以明显增强DC的活性(P<0.05)。     

超抗原SEB的免疫抑制作用及其机制的初步研究

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素SEB作为超抗原的免疫抑制性作用及其可能机制.方法 BALB/c小鼠注射金黄色葡萄球菌B 型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B, SEB) ,分离其脾脏细胞,研究SEB刺激小鼠脾细胞产生的反应,并通过FCM检测脾细胞表面CD4和CD25分子的表达情况,探讨其内在机制.结果 FCM表明与生理盐水对照组相比,注射过SEB 后的BALB/c 小鼠的脾脏细胞中CD4和CD25双阳性细胞比例增加,提示SEB的免疫抑制作用可能和其诱导调节性T细胞有关.结论 SEB 可以在小鼠体内有效诱发具有抑制活性的调节性细胞,这可能是SEB在动物体内诱发免疫低反应的机制之一.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠树突状细胞表面I-Eκ分子表达的影响

目的　探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对小鼠树突状细胞 (DC)表面I-Eκ 分子表达的影响。方法　密度梯度离心获得小鼠脾单个核细胞 ,Panning法纯化非贴壁细胞得到DC ;免疫组化SABC法检测DC纯度 ;流式细胞术检测SEB刺激后DC表面I -Eκ 分子的表达。结果　DC纯度为 70 %～ 80 %。I -Eκ 的表达在 10 0ng/mlSEB刺激 8h后达到高峰。结论　SEB可显著提高DC表面I -Eκ 分子的表达 ,该刺激作用有一最佳量效和时效关系。     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠树突状细胞表面I—E^k分子表达的影响

目的 探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）对小鼠树突状细胞（DC）表面I－E^k分子表达的影响。方法 密度 度离心获得小鼠脾单个核细胞，Panning法纯化非贴壁细胞得到DC；免疫组化SABC法检测DC纯度；流式细胞术检测SEB刺激后DC表面I－E^k分子的表达。结果 DC纯度为70％－80％。I－E^k的表达在100ng/mlSEB刺激8h后达到高峰。结论 SEB可显著提高DC表面I－E^k分子的表达，该刺激作用有一最佳最效和时效关系。     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C及其突变体在抗肿瘤和骨科治疗中的应用进展

金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)是一种由金黄色葡萄球菌产生的超抗原,具有强大的T细胞活化增殖能力,中国SEC生物制剂(金葡素注射液)应用于临床抗肿瘤及骨科疾病的治疗。但SEC作为一种天然肠毒素,具有一定的免疫毒性,可导致发热、呕吐、腹泻等不良反应,一定程度上限制了金葡素注射液的临床应用。为提高SEC的超抗原特性,减少毒性,现已开发出多种SEC突变体蛋白,未来可生产出更安全、高效、低毒性或无毒性的生物制剂,扩大SEC的临床应用范围,治疗更多疾病。     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的检测

[摘要]目的 检测临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况。方法 根据Genbank的序列设计合成金黄色葡萄球菌肠毒素基因A-F的引物,采用聚合酶链反应方法对随机收集的124株金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行检测,并进行序列分析。结果 在124株受检的金黄色葡萄球菌中,116株检出肠毒素基因,检出率为93.5%,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%,7.8%,13.8%。序列分析显示所检出的肠毒素基因与Genbank上登陆的参考序列的同源性为97%～100%。结论 金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因携带率高,其中以携带SEA、SEC、SEF基因为主。     

人转铁蛋白—葡萄球菌肠毒素B偶联蛋白的抗肿瘤活性

目的 研究人转铁蛋白（ＨｕＴｆ）与金黄色葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）偶联后,其Ｔｆ－ＳＥＢ偶合蛋白的抗肿瘤活性,探讨Ｔｆ作为载体用于肿瘤导向免疫治疗的可能性。方法 利用凋亡细胞指数检测和超抗原依赖的细胞介导的细胞毒（ＳＤＣＣ）效应,观察该偶合蛋白的超抗原活性和激活Ｔ细胞杀伤肿瘤细胞的作用。结果 Ｔｆ－ＳＥＢ偶合蛋白比单体ＳＥＢ能更有效地激活Ｔ细胞的杀伤肿瘤细胞活性,并对ＭＨＣ－Ⅱ类分子阴性的肿瘤瘤细     

Tf-SEB偶合蛋白对荷瘤小鼠的疗效及其机理探讨

目的研究人转铁蛋白(Tf)与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)偶联后,在体内对肿瘤的治疗效果及其机理。方法采用化学方法将Tf与SEB偶联成Tf-SEB偶联蛋白,观察该偶联蛋白对荷瘤小鼠的疗效;采用免疫细胞化学方法初步探讨该偶联蛋白在体内的抗肿瘤机理。结果偶联蛋白处理组动物的肿瘤发生率和死亡率及肿瘤体积均显著低于单体SEB处理组和其它各组;免疫细胞化学结果显示,偶联蛋白处理的动物肿瘤组织内有更为明显的CD4     

卵清蛋白、金黄色葡萄球菌肠毒素B和维生素D类似物诱导 小鼠特应性皮炎模型

目的：阐明利用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)和 维生素D类似物(calcipotriene ointment,CO)局部刺激小鼠背部建立特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)动物模型的方法。 方法：将BALB/c小鼠背部去毛随机分为3组：对照组,OVA/SEB,OVA/SEB/CO,分别给予相应的处理。隔天给药 并拍照记录皮损状态,于第15天处死小鼠,处死前用皮肤共聚焦显微镜测量表皮厚度。用ELISA方法检测血清IL-2, IL-4,IL-31,干扰素(interferon,IFN)-γ,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和IgE水平,HE染色检测皮损处炎症情况,实时荧光定量PCR检测皮损处上述因子的mRNA表达水平。 结果：OVA/SEB/CO组皮损处炎症细胞浸润和表皮增厚明显,血清IgE水平显著增高,血清和皮损处IL-4,IL-31, IFN-γ,TNF-α和NGF表达水平均显著高于对照组或OVA/SEB组。结论：OVA/SEB/CO局部刺激可短时间、低成本地 诱导BALB/c小鼠皮肤AD样改变。     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

Background  Objective evaluation of the antitumor effect of interleukin-12 (IL-12) gene-transfected dendritic cell (DC) vaccine on laryngeal carcinoma requires in vivo and in vitro tests. The aim of this study was to investigate the function of IL-12 gene transfected DC at initiating specific immune response to laryngeal carcinoma in vitro．

Methods  Recombinant adenovirus with IL-12 gene was constructed. DCs were isolated from the peripheral blood of patients with laryngeal carcinoma, pulsed with tumor lysate of laryngeal carcinoma cells (DC⁺Ag), and transfected with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag). The cells pheotypes including CD83, CD86 and HLA-DR on surface of DCs were assayed by flow cytometry (FCM). The concentration of IL-12 in culture supernatant of DCs and interferon γ (IFN-γ) in culture supernatant of T cells cocultured with DCs were quantified by ELISA. Methyl thiazolys tetrazolium (MTT) was used to evaluate proliferation of autologous T lymphocytes and activation of cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by IL-12-transfected DCs pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells.

Results  The recombinant adenovirus expressing IL-12 gene was constructed successfully. Gene-transfected DC plused with tumor lysate with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag) expressed higher level of CD83, CD86 and produced higher level of IL-12 than untransfected DCs (DC⁺Ag) (CD83: (60.2±1.8)% vs. (50.7±1.2)%, P <0.05; CD86: (88.9±2.1)% vs. (78.2±3.9)%, P <0.05; IL-12: (262.5±3.0) ng/L vs. (103.8±5.1) ng/L, P <0.05). The proliferation of autologous T lymphocytes and production of IFN-γ stimulated by DC transfected with IL-12 were more obviously than untransfected DCs. Cytotoxicity of CTL stimulated by IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells were significantly stronger than stimulated by untransfected DC.

Conclusion  It is a promising approach for IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate to increase the antitumoral effect.

     

SEB基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性研究

目的 构建葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因及其突变体原核表达系统,了解突变前、后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化.方法 采用突变引物PCR构建SEB基因定位突变体,建立SEB基因及其定位突变体原核表达系统;同时采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的 重组蛋白;采用TCID50法测定目的 重组蛋白对Vero细胞的毒性;采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的 重组蛋白促使小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用.结果 所克隆的SEB基因核苷酸序列与各项研究报道的相似性为100%,3种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变.rSEB和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的40%;rSEB对Vero细胞TCIC50为3.4μg,其突变体重组蛋白分别为3.2～16.8μg;1和5μg/ml的rSEB及突变体重组蛋白rSEB/D9N对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用（P＜0.05）,10和20μg/ml的rSEB及rSEB/D9N促进小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml植物血凝素PHA相似（P＞0.05）.5～20μg/ml的rSEB及rSEB/D9N作用的小鼠脾细胞上清液及其上清液与脾细胞混合物均能有效抑制KB和HL-60细胞生长（P＜0.05）.结论 本研究成功构建了SEB基因突变体及其高效原核表达系统;其中突变体重组蛋白rSEB/D9N细胞毒性较低,促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升高白细胞、抗肿瘤的SEB相关药物的候选突变体.     

孕鼠给予葡萄球菌肠毒素B对新生子代鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响

目的:观察妊娠期孕鼠给予葡萄球菌肠毒素B（SEB）对其新生子代鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响。方法:在SD大鼠妊娠第16天给予尾静脉注射15 μg SEB,同时设立磷酸盐缓冲液（PBS）对照组。获取出生后3d的新生鼠脾脏并分离淋巴细胞,将淋巴细胞与ConA或SEB共培养3 d,流式细胞仪检测新生鼠脾脏淋巴细胞亚群,液体闪烁仪测定细胞的增殖能力。结果:SEB组新生鼠脾脏中CD4+T细胞比例在ConA或SEB刺激第1天分别较PBS组明显增加,但在第2~3天却明显降低（P<0.05~P<0.01）;而SEB组新生鼠脾脏中CD4+TCR Vβ8.2+T细胞比例在ConA或SEB刺激的第1天及CD8+ TCR Vβ8.2+ T细胞比例分别较PBS组明显增加（P<0.05~P<0.01）。SEB组新生鼠脾脏淋巴细胞在ConA或SEB刺激后第1天增殖能力明显强于PBS组,但在第2~3天的增殖能力却又明显低于PBS组（P<0.05~P<0.01）。结论:妊娠期孕鼠给予SEB可以影响新生鼠脾脏淋巴细胞的体外增殖。     

妊娠期母鼠给予葡萄球菌肠毒素B对成年子代CD3+TCR Vβ8+T细胞的影响

目的观察妊娠期母鼠给予葡萄球菌肠毒B（SEB）对成年子代CD3+ TCR Vβ8+ T细胞的影响。方法在妊娠16 d时给予
SD大鼠尾静脉注射15 μg SEB,同时设立PBS对照组。孕鼠自然分娩后子代鼠生长至成年,流式细胞仪检测成年子代鼠胸腺
及外周血中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞;并观察成年子代鼠再次给予SEB时胸腺及外周血中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞的应答变化。
结果妊娠期母鼠给予SEB可导致雌、雄性成年子代鼠胸腺CD3+ TCR Vβ8+ T细胞的比例（雌性：1.760,雄性：1.098）,较对照组
的（雌性：2.714,雄性：2.088）明显减少（P<0.05）,其外周血中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞的变化与胸腺中类似。PBS组的雌雄性成
年子代鼠给予SEB后其胸腺及外周血中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞较同窝对照组明显减少（P<0.05）;而SEB组的雌雄性成年子代
鼠给予SEB后与其同窝PBS对照组比较,胸腺中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞无变化（P>0.05）,但外周血中CD3+ TCR Vβ8+ T细胞则
明显增加（P<0.05）。结论妊娠期母鼠给予SEB改变其成年子代大鼠CD3+ TCR Vβ8+ T细胞对再次SEB刺激的应答方式。
     

金黄色葡萄球菌肠毒素基因定位研究

对40株产1种或1种以上肠毒素的金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）进行分析，结果全部金葡菌肠毒素A（SEA，12/12）、金葡菌肠毒素C（SEC，19／19）、大部分金葡菌肠毒素B（SEB，23／28）的产生不因质粒的消除而消失，说明SEA、SEC的基因位点在染色体上。有5株金葡菌因质粒消除而失去产SEB的能力，其基因位点，可能在质粒或染色体上。4株金葡菌亦均因质粒消除失去产金葡菌肠毒素D的能力，其基因位点可能在质粒上。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α的影响

目的　观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对淋巴细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF)-α的影响。方法　密度梯度离心法获得鼠脾淋巴细胞 ,不同时间和浓度的SEB处理 ,流式细胞仪检测产生TNF -α的淋巴细胞阳性率。结果　TNF -α的产生在 5d和 10 0ng·ml-1时达到高峰。结论　SEB能有效刺激淋巴细胞产生TNF -α。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。