核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

【摘要】 目的 研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达,及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过 qRT-PCR分析 E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达,免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞,通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均P < 0.001）。qRT-PCR显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09,t = 3.22,P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均P < 0.001）,而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均P < 0.001）。相关性分析显示,恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：r = -0.56,Western印迹：r = -0.63,均P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后,E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（t = 3.38、2.76,P < 0.001）。CCK-8实验显示,继续培养后48 h,E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（t = 4.58,P < 0.01）;软琼脂平板实验显示,E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（t = 2.26,P＜0.001）;迁移实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22,t = 3.14,P < 0.01）;侵袭实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31,t = 2.12,P < 0.01）;3D细胞培养实验显示,E2F6抑制组细胞形态发生明显变化,侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示,E2F6抑制组G0 - G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均P < 0.001）。Western印迹显示,E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（P < 0.001）,P21蛋白水平高于对照组（P＜0.001）;E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（P < 0.001）,而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（P < 0.001）。结论 核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达,敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ，应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系，构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组，经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力，采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力，采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示，相对于癌旁组织，ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825，P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示，shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073，shCtrl组为1.000 ± 0.244，两组比较，t = 9.461，P < 0.001，蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115，t = 8.595，P = 0.002， 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示，shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%，t = 6.464，P = 0.003），且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组划痕愈合减慢，划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%，t = 5.835，P = 0.004）至24 h明显降低，通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139，t = 12.411，P < 0.001）。Western印迹显示，shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

核蛋白14对黑素瘤新生血管形成的影响及机制研究

目的 分析核蛋白14 （NOP14）对黑素瘤血管形成的影响。方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织,免疫组化检测NOP14和CD31［以微血管密度（MVD）表示］的表达。将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组,分别转染空载体（空载体组）、NOP14过表达载体（NOP14组）、靶向NOP14的siRNA（siNOP14组）和阴性对照siRNA（siNC组）。荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达,Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达。利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型,利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力。采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系,多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异,其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验。结果 NOP14高表达组（20例）黑素瘤组织MVD为44 ± 13,中表达组（17例）为58 ± 16,低表达组（3例）为62 ± 11,且NOP14表达和MVD呈负相关（r = -0.525,P = 0.017）。与空载体组相比,NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低（P < 0.05）。与siNC组相比,siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高（P < 0.05）。在A375与HUVEC共培养模型中,与空载体共组相比,NOP14组HUVEC的增殖活性（F = 131.85,P < 0.05）和迁移细胞数［22 ± 5比63 ± 8,t = 7.07,P = 0.002）、侵袭细胞数（14 ± 5比45 ± 10,t = 4.94,P = 0.008）及分支节点数（8 ± 2比14 ± 3,t = 5.06,P < 0.001）均显著下降;与siNC组相比,siNOP14组HUVEC的增殖活性（F = 79.92,P < 0.01）和迁移细胞数（152 ± 30比59 ± 4,t = 5.36,P = 0.006）、侵袭细胞数（134 ± 21比50 ± 8,t = 6.40,P < 0.001）及分支节点数（27 ± 3比15 ± 4,t = 6.10,P < 0.001）显著升高。在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中,各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致。结论 黑素瘤组织中 NOP14表达和MVD呈负相关,NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用。     

微小RNA-181b-5p对皮肤黑素瘤细胞株增殖和侵袭的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨微小RNA（miRNA）-181b-5p是否通过靶向普列克底物蛋白（PLEK）抑制皮肤黑素瘤（CM）细胞的增殖及侵袭能力。方法 生物信息学分析CM核心基因;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181b-5p和PLEK的靶向结合。采用RNA oligo和siRNA分别调控A375细胞miRNA-181b-5p和PLEK的表达,具体分组为：模拟物阴性对照组、miRNA-181b-5p模拟物组、抑制剂阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂组、PLEK siRNA组、siRNA阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组以及miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA3共转染组。上述各组用相应试剂处理细胞48 h后,采用qPCR检测A375细胞中miRNA-181b-5p和PLEK mRNA的表达,Western印迹检测PLEK蛋白的表达,Transwell小室侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力;继续培养24 ~ 96 h后,CCK8实验检测A375细胞增殖能力。结果 PLEK为CM的核心基因,CM原位癌组织较癌旁组织高表达PLEK（P = 0.031）,转移组织较原位癌组织高表达PLEK（P = 0.001）。与人表皮黑素细胞HEMa-LP相比,A375细胞高表达PLEK mRNA（3.884 ± 0.156比0.997 ± 0.010,t = 18.48,P < 0.001）及PLEK蛋白（2.840 ± 0.301比1.029 ± 0.094,t = 5.47,P = 0.005）,低表达miRNA-181b-5p（0.333 ± 0.042比0.967 ± 0.069,t = 7.83,P = 0.001）。双荧光素酶报告基因实验显示,miRNA-181b-5p和PLEK靶向结合。与模拟物阴性对照相比,miRNA-181b-5p模拟物转染后A375细胞的存活率显著降低（48 h,t = 7.96,P = 0.015;72 h,t = 7.50,P = 0.002;96 h,t = 7.96,P = 0.001）,侵袭能力也显著降低（t = 5.07,P = 0.007）;相反miRNA-181b-5p 抑制剂组A375细胞存活率高于抑制剂阴性对照组（24 h,t =5.38,P = 0.013;48 h,t = 5.36,P = 0.013;72 h,t =7.63,P = 0.005;96 h,t =5.99,P = 0.004）,侵袭能力也高于抑制剂阴性对照组（t = 7.24,P = 0.002）;与对照siRNA组相比,PLEK siRNA转染后A375细胞的增殖能力降低（48、72、96 h时,P值分别为0.015、0.011、0.001）,侵袭能力也降低（t = 4.93,P = 0.008）;与miRNA-181b-5p 抑制剂和对照 siRNA共转染组相比,miRNA-181b-5p 抑制剂和PLEK siRNA共转染组A375细胞的增殖率明显降低（24、48、72、96 h时,P值分别为0.042、0.042、0.037、0.017）,侵袭能力也明显降低（t = 8.52,P = 0.001）。结论 miRNA-181b-5p抑制A375细胞增殖和侵袭能力,其机制涉及靶向下调PLEK的表达。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

miR-203调控锌指蛋白281表达对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响

【摘要】 目的 初步探究微小RNA-203（miR-203）调控锌指蛋白281（ZNF281）对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法 常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2,实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况,Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组：对照组（细胞正常培养）、miR-203模拟物对照组（加入miR-203模拟物阴性对照）、miR-203抑制剂对照组（加入miR-203抑制剂阴性对照）、miR-203模拟物组（加入miR-203模拟物）、miR-203抑制剂组（加入miR-203抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达,CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性,Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量,Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q法。结果 与血管内皮细胞系ECV304相比,黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白水平较高（均P < 0.05）。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比,miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高（F = 487.632、68.454,均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著降低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白表达均显著降低（均P < 0.05）;miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低（均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著增加（均P < 0.05）,A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高（均P < 0.05）,36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高（均P < 0.05）,24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高（均P < 0.05）。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。结论 上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移,下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移,可能通过调控ZNF281的表达实现。     

阿扎胞苷对黑素瘤A375细胞HOXA9基因表达及生物学行为的影响

【摘要】 目的 研究甲基转移酶抑制剂阿扎胞苷（5-azaC）对黑素瘤A375细胞中同源框A9（HOXA9）基因表达及细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 1、5、10、20 μmol/L 5-azaC分别作用于体外培养的A375细胞，以未经药物干预的常规培养A375细胞作为对照组，甲基化特异性PCR检测不同浓度5-azaC处理后HOXA9基因启动子区甲基化状态，筛选5-azaC最佳浓度进行后续实验。细胞计数试剂盒（CCK8）检测5-azaC对A375细胞增殖能力的影响，Transwell及细胞划痕实验分析5-azaC对A375细胞侵袭及迁移能力的影响，实时荧光定量PCR及Western印迹检测5-azaC作用后A375细胞中HOXA9 mRNA及蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本t检验。结果 对照组A375细胞中HOXA9基因启动子区表现为甲基化状态，经5-azaC处理后，A375细胞中HOXA9基因启动子区甲基化与非甲基化状态并存，且随5-azaC处理浓度的增加，HOXA9基因去甲基化程度越高，因此选择20 μmol/L 5-azaC浓度处理A375细胞72 h作为5-azaC处理组，用于后续实验。与对照组相比，5-azaC处理组A375细胞增殖能力显著降低（72.46% ± 2.19%比100%，t = 28.09，P < 0.001），侵袭细胞数量显著减少［（242.70 ± 29.19）个比（466.00 ± 22.65）个，t = 10.47，P < 0.001］，迁移能力减弱（27.56% ± 2.74% 比35.69% ± 2.50%，t = 3.79，P = 0.019），HOXA9 mRNA表达量升高（1.73 ± 0.28 比1.01 ± 0.15，t = 3.93，P = 0.017），HOXA9蛋白表达量增多（0.62 ± 0.03比0.50 ± 0.01，t = 3.82，P = 0.019）。结论 5-azaC能够降低黑素瘤细胞株A375的增殖、侵袭、迁移能力，且该过程可能机制之一是5-azaC反转HOXA9基因启动子区甲基化状态，激活基因表达，从而参与调控黑素瘤细胞生物学行为。     

姜黄素对人黑素瘤细胞株A375和C8161细胞AKT/mTOR信号通路的影响

目的 探讨姜黄素对恶性黑素瘤体外抗癌作用的分子机制。 方法 体外培养的人黑素瘤细胞株A375和C8161分为实验组和对照组。实验组经不同浓度姜黄素处理一定时间,对照组采用二甲基亚砜处理。采用噻唑蓝法检测姜黄素对A375和C8161细胞增殖的影响,体外侵袭实验检测姜黄素对A375和C8161细胞侵袭的影响,流式细胞仪检测姜黄素对A375和C8161细胞周期的影响,Western 印迹检测姜黄素对A375和C8161细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。 结果 噻唑蓝法显示,姜黄素分别在5 ~ 15 mg/L和5 ~ 10 mg/L浓度时,对A375和C8161细胞抑制作用呈量效关系;在0 ~ 48 h呈时效关系,与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.001）。其24 h的IC50分别为10 mg/L和5 mg/L。体外侵袭试验显示,10 mg/L和5 mg/L姜黄素分别作用于A375和C8161细胞72 h,可明显抑制细胞侵袭（P < 0.001）。流式细胞仪检测显示,10 mg/L和5 mg/L姜黄素分别作用于A375和C8161细胞24 h,细胞周期阻滞于G2/M期; A375细胞G2/M期比例为35.00% ± 3.54%,与对照组120.80% ± 7.46%相比,差异有统计学意义（P < 0.001）;C8161细胞G2/M期比例为19.33% ± 4.04%,与对照组85.00% ± 9.53%相比,差异有统计学意义（P < 0.001）。Western印迹检测显示,分别经10 mg/L和5 mg/L姜黄素作用于后,A375和C8161细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平下降。结论 姜黄素抑制人黑素瘤细胞株A375和C8161增殖及侵袭机制可能与其诱导细胞周期阻滞及抑制AKT/mTOR信号通路活化有关。     

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法 体外培养人黑素瘤细胞株A375;噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果 MTT结果显示,在24 h干预点,罗格列酮浓度为10、25 μmol/L 时,对A375细胞增殖抑制率分别为（4.86 ± 0.31）%、（5.15 ± 0.52）%,细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P < 0.01）,并上调TIMP2 mRNA的表达（P < 0.01）。侵袭实验显示,对照组、10 μmol/L罗格列酮组、25 μmol/L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210.7 ± 14.9,154.1 ± 7.7,87.3 ± 8.1,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移,可能与其下调MMP2的表达有关。     

光动力作用对人血管内皮细胞分泌TNF-α的影响

目的 观察血卟啉单甲醚光动力疗法(HMME-PDT)处理人血管内皮细胞(EC-304)后分泌TNF-α浓度变化,以探讨细胞因子与光动力疗法治疗鲜红斑痣后出现炎症反应的关系.方法将EC-304接种于6孔培养板,实验分为HMME-PDT实验组,HMME对照组,激光对照组,空白对照组.实验组在光动力疗法处理后12、24、48h分别取上清液,对照组于换液后相同时间点分别取上清液.ELISA法测量4组TNF-α的分泌量.结果每一组TNF-α在不同时间点的含量存在差异(F=62.276,P<0.01),4组之间TNF-α的含量在每个相同的时间点不完全相等(F=11.538,P<0.01),经多重比较,实验组与3组对照组之间TNF-α的含量在每个相同的时间点均有差异(P<0.01),3组对照组之间在每个相同的时间点的含量差异无统计学意义(P>0.05).结论 HMME-PDT可促进EC-304分泌TNF-α.     

慢性自发性荨麻疹患者外周血IL-35水平检测及其对血管内皮细胞VCAM-1的抑制作用

目的：检测慢性自发性荨麻疹（CSU）患者外周血IL-35水平,明确其对肥大细胞活化的血管内皮细胞表面血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)表达的抑制效应。方法：收集30例CSU患者和30例健康对照者外周血,利用Luminex液相芯片检测血清IL-35和可溶性VCAM-1（sVCAM-1）浓度。体外培养肥大细胞,与患者外周血清共孵育24h,取上清液 、IL-35 与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养,分为空白对照组（仅含RPMI 1640培养液）、健康人上清液组（HC）、CSU上清液组（CSU）、HC+IL-35组、CSU+IL-35组,流式细胞术检测VCAM-1蛋白表达,荧光显微镜观察单个核细胞和内皮细胞的粘附。结果：与健康对照者相比,CSU患者组外周血IL-35浓度显著降低,血清sVCAM-1浓度显著升高,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 CSU血清IL-35与sVCAM-1浓度呈负相关（r=-0.5232 P=0.003）。IL-35+CSU组内皮细胞VCAM-1表达及单个核细胞与内皮细胞粘附情况显著低于CSU组,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：CSU患者外周血IL-35降低,升高IL-35浓度可抑制CSU患者肥大细胞对血管内皮细胞的活化作用。     

葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及对角蛋白17、STAT3、VEGF表达的影响

目的 探讨葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及角蛋白17(K17)、信号转导及转录激活子3(STAT3)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用不同浓度葫芦素Ⅰ(0.0125、0.025、0.05、0.1μmol/L)、含与0.1 μmol/L葫芦素Ⅰ等体积DMSO的DMEM培养液(溶媒组)、DMEM培养液(阴性对照组)、10 nmol/L卡泊三醇(阳性对照组)分别作用于HaCaT细胞.采用CCK8法检测葫芦素Ⅰ作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响,RT-PCR法检测葫芦素Ⅰ作用24 h对HaCaT细胞K17和VEGF mRNA表达的影响,Western印迹法检测葫芦素Ⅰ作用24h对HaCaT细胞K17、STAT3、磷酸化STAT3(P-STAT3)和VEGF蛋白表达的影响.结果 0.0125 μmol/L葫芦素Ⅰ作用12h即开始表现出对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用,当葫芦素Ⅰ浓度增加到0.1 μmol/L时,24h和36h的抑制率分别为43.00％±2.11％和48.98％±2.27％.与阴性对照组相比,各浓度葫芦素Ⅰ组对HaCaT细胞体外增殖均有抑制作用(均P＜ 0.05),且该抑制作用随葫芦素Ⅰ浓度的增加及作用时间的延长逐渐增强.不同浓度葫芦素Ⅰ作用于HaCaT细胞24 h后,K17 mRNA及其蛋白、P-STAT3蛋白、VEGF mRNA及其蛋白表达量均随葫芦素Ⅰ浓度的增加而降低,差异有统计学意义(均P＜ 0.05).结论 葫芦素Ⅰ可抑制HaCaT细胞的体外增殖,并可在mRNA水平下调K17、VEGF的表达,在蛋白水平下调K17、P-STAT3、VEGF的表达.     

激光照射对体外培养的婴儿血管瘤内皮细胞相关生长因子及细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 研究激光照射对体外培养的婴儿血管瘤内皮细胞相关生长因子及细胞凋亡的影响。方法 活化培养的婴儿血管瘤内皮细胞分为3组,强脉冲光（IPL）组（23 J/cm2,照射1次）、激光组（1 064 nm Nd：YAG激光,90 J/cm2,照射1次）和对照组（不照射激光）。照射后第1、3、7天,RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体2（VEGFR-2）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）mRNA的表达,Western印迹检测VEGFR-2蛋白表达,ELISA检测细胞上清液中VEGF和bFGF的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 与对照组相比,1 064 nm Nd：YAG激光照射后第7天,VEGF mRNA（0.363 ± 0.021比1.000 ± 0.023）、VEGFR-2 mRNA（0.483 ± 0.017比1.001 ± 0.031）、bFGF mRNA（0.402 ± 0.040比1.000 ± 0.004）表达均下降,VEGFR-2蛋白表达下降（0.332 ± 0.055比0.768 ± 0.096）,VEGF［（69.389 ± 24.179） ng/L比（334.506 ± 13.084） ng/L］和bFGF［（2.386 ± 0.151） ng/L比（9.165 ± 0.232） ng/L］分泌减少,细胞凋亡率（18.413% ± 2.654%比4.300% ± 0.036%）上升,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比,IPL组照射后第7天VEGF mRNA（0.436 ± 0.041比1.000 ± 0.023）、VEGFR-2 mRNA（0.493 ± 0.037比1.001 ± 0.031）、bFGF mRNA（0.490 ± 0.044比1.000 ± 0.004）表达下降,VEFGR-2蛋白表达下降（0.406 ± 0.037比0.768 ± 0.096）,VEGF［（128.858 ± 6.063） ng/L比（334.506 ± 13.084） ng/L］和bFGF［（2.723 ± 0.471） ng/L比（9.165 ± 0.232） ng/L］分泌减少,细胞凋亡率上升（16.597% ± 1.877%比4.300% ± 0.036%）,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 1 064 nm Nd：YAG激光可能通过调节VEGF/VEGFR-2信号通路上的关键因子,以及细胞凋亡发挥对血管瘤内皮细胞的抑制作用,从而达到治疗血管瘤的作用。     

复方昆明山海棠对TNF-α诱导的人血管内皮细胞ICAM-1表达影响的试验研究

目的通过复方昆明山海棠对TNF-α诱导的人血管内皮细胞ICAM-1表达影响的研究,探讨复方昆明山海棠的抗炎机制。方法采用体外细胞培养、免疫组化技术观察复方昆明山海棠对TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子ICAM-1表达的影响。结果复方昆明山海棠（0.05～2）mg/ml预处理30min,可不同程度地抑制TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达,与空白对照组相比较有统计学意义（P〈0.05）;到2mg/ml时ICAM-1的表达减到最弱（P〈0.01）。结论复方昆明山海棠能明显抑制TNF-α诱导的人血管内皮细胞表面黏附分子ICAM-1表达,（0.05-2）mg/ml范围内其抑制作用的强弱与浓度有关。提示复方昆明山海棠有可能是通过抑制人血管内皮细胞表面黏附分子ICAM-1的表达从而减少白细胞与血管内皮的黏附来发挥其抗炎作用的。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。     

白介素-35在前列腺癌患者血清中的表达及对前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨白介素-35(IL-35)在前列腺癌患者血清中的表达及其与临床病理特征?预后的关系,以及沉默IL-35对人前列腺癌PC-3细胞增殖?迁移与侵袭的影响。方法选取2014年1月至2015年11月于新疆医科大学第二附属医院接受手术治疗的66例前列腺癌患者纳入癌症组,另选取20例同期体检的健康男性纳入健康组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-35水平,分析其与前列腺癌患者临床病理参数的关系。选取人前列腺癌PC-3细胞为研究对象,分为Control组(无任何处理)?空质粒组(转染Si-NC)?IL-35组(转染Si-IL-35)。噻唑蓝(MTT)法?克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot法检测各组细胞中JAK2?STAT3?p-JAK2?p-STAT3蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测P35?EBI3?JAK2?STAT3?p-JAK2?p-STAT3的mRNA表达水平。结果癌症组血清IL-35表达水平高于健康组(P=0.000);不同前列腺特异性抗原(PSA)水平?Gleason评分?TNM分期?远处及淋巴结转移前列腺癌患者的IL-35水平比较,差异具有统计学意义(P=0.000);沉默IL-35后PC-3细胞的增殖?迁移和侵袭能力均显著降低(P<0.01);细胞中p-JAK2?p-STAT3?p-JAK2-mRNA?p-STAT3-mRNA,以及P35?EBI3基因mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论IL-35在前列腺癌中高表达,沉默IL-35可抑制PC-3细胞增殖?迁移和侵袭,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

全反式维A酸对恶性黑素瘤A375细胞上皮-间质转化相关分子表达的影响

【摘要】 目的 研究全反式维A酸（ATRA）对人恶性黑素瘤A375细胞中上皮-间质转化（EMT）相关分子表达的影响。方法 用含10 μmol/L ATRA的DMEM培养基和DMEM培养基分别处理A375细胞24和48 h作为ATRA-1组和ATRA-2组、对照1组和对照2组,采用实时定量PCR法检测EMT相关基因上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达。Western印迹法检测ATRA-1组、ATRA-2组、对照1组中上述蛋白的相对表达量,直接免疫荧光法检测上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的荧光强度。统计分析采用两因素方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验。结果 ATRA-1组和ATRA-2组分别与对照1组和对照2组相比,上皮钙黏着蛋白mRNA的表达均显著增加（F = 13.148、31.529,P < 0.05）,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达均显著降低（均P < 0.05）;ATRA-2组上皮钙黏着蛋白mRNA的表达显著高于ATRA-1组（F = 13.148,P < 0.05）,而其他3种蛋白mRNA的表达显著低于ATRA-1组（均P < 0.05）;对照1组与对照2组上述蛋白的mRNA表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹法显示,与对照1组相比,ATRA-1组和ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达均下调（均P < 0.05）;与ATRA-1组相比,ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调（P < 0.05）,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达下调（均P < 0.05）。直接免疫荧光显示,ATRA-1组、ATRA-2组上皮钙黏着蛋白的荧光强度（6.23 ± 0.08、10.37 ± 0.13）显著高于对照1组（2.37 ± 0.14,均P < 0.05）,而波形蛋白的荧光强度（15.17 ± 0.18、10.29 ± 0.03）显著低于对照1组（50.16 ± 0.26,均P < 0.05）,抑制上皮向间质转化。结论 ATRA可上调A375细胞中上皮钙黏着蛋白的表达,降低神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达,可能抑制A375细胞发生EMT现象。     

卡泊三醇软膏联合阿维A对银屑病患者PASI指数及VEGF水平的影响

目的研究卡泊三醇软膏联合阿维A对银屑病的疗效。方法选择2016年1月2018年1月我院收治的158例银屑病患者,随机分为2组。对照组仅服用阿维A胶囊治疗,观察组联用卡泊三醇软膏治疗。均治疗1个月,观察2组患者的银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)及血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-23水平的改变。结果观察组的有效率明显高于对照组(P<0.05);2组治疗后的PASI及血清VEGF水平均明显降低(P<0.05),且观察组更低(P<0.05);2组治疗后的血清IL-17、TNF-α、IL-23水平均明显降低(P<0.05),且观察组更低(P<0.05)。结论卡泊三醇软膏联合阿维A对银屑病有确切的疗效,其机制可能与促进血管内皮细胞增殖,减轻炎性反应,增强机体的免疫功能相关。