绿茶提取物及羟氯喹对表皮细胞光保护生物学效应的研究

目的观察羟氯喹及没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)对中波紫外线(UVB)照射引起的人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞增殖活性变化及凋亡的影响。方法采用剂量分别为0、30、60、90mJ/cm~2的UVB照射培养的HaCaT细胞并加入羟氯喹及EGCG,共孵育24h后以四甲基偶氮唑蓝还原法(MTT)检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率变化。结果UVB照射后HaCaT细胞出现增殖活性下降,其幅度与辐射强度成正比;加入羟氯喹及EGCG可使细胞活性有一定程度恢复;此外,UVB照射可诱导HaCaT细胞产生凋亡,凋亡率呈UVB剂量依赖方式增加;30mJ/cm~2UVB照射可使HaCaT细胞出现明显S期阻滞,随UVB剂量增大,S期细胞数量相对下降;加入药物处理可抑制上述改变。结论羟氯喹和EGCG可明显抑制UVB引起的HaCaT细胞增殖活性下降、凋亡与细胞周期阻滞。     

长波紫外线照射对HaCaT细胞iNOS/NO表达的影响

目的 探讨不同剂量长波紫外线 （UVA） 照射HaCaT细胞后不同时间点诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的表达情况。方法 1 J/cm2、5 J/cm2和10 J/cm2 UVA照射HaCaT细胞后继续培养24 h、48 h和72 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;分别用RT-PCR、Western印迹和Griess法检测HaCaT细胞iNOS mRNA、蛋白及NO的表达。结果 所有UVA剂量组HaCaT细胞iNOSmRNA在光照后24 h有表达,48 h达高峰,72 h后下降,各时间点间表达量差异有统计学意义（P < 0.05）;1 J/cm2 UVA照射后3个时间点均未见iNOS蛋白表达,而5 J/cm2和10 J/cm2 UVA照射后iNOS蛋白在24 h增加,48 h达高峰且显著高于24 h（P < 0.05）,照射后72 h无iNOS蛋白表达。所有UVA剂量组HaCaT细胞NO表达量在24 h升高,48 h显著升高,72 h平稳升高,3个时间点NO表达量均比正常对照组明显增加（P < 0.05）。对照组HaCaT细胞无iNOS mRNA和蛋白表达,NO表达量低。结论 HaCaT细胞iNOS和NO的表达变化与UVA照射存在时间和剂量关系。     

电子自旋共振捕捉技术测定与黑素结合的羟基氯喹对羟自由基的清除

目的:观察与黑素结合的羟基氯喹(HCQ)对Fenton反应瞬时产生羟自由基([·OH])的清除能力,以阐述抗疟药物的抗炎和抗皮肤光敏感性作用的分子机制.方法:利用Fenton反应瞬时产生[·OH],将不同浓度的HCQ和细菌衍生黑素结合后加入Fenton反应体系,用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)捕捉[·OH],用电子自旋共振(ESR)仪记录DMPO-OH特征波谱,通过测量反应体系中自由基的减少量算出该样品对[·OH]的清除率.结果:细菌衍生黑素在20～100 mg/L浓度范围对自由基的清除呈剂量依赖性,在100 mg/L浓度时对[·OH]的清除率达92.5％; HCQ对[·OH]的清除呈非剂量依赖性,50 μmol/L HCQ呈现出最大的清除率(43.72％);10 μmol/L HCQ与黑素结合后对[·OH]清除能力与单纯HCQ组相比显著增加(P＜0.05),提高与黑素结合的HCQ浓度并不能增加对自由基的清除率.结论:一定浓度的HCQ与黑素结合可增加皮肤细胞对活性氧基的瞬时清除能力.     

抗组胺药抑制长波紫外线辐射诱导HaCaT细胞生成IL-6

目的观察长波紫外线辐射对体外培养的HaCaT细胞产生IL-6的影响及抗组胺药的作用。方法用不同剂量长波紫外线辐射培养的HaCaT细胞,加入不同浓度的异丙嗪及西咪替丁(分别为0,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L),在不同时点收集上清液,ELISA检测IL-6浓度。结果与未辐射组相比,HaCaT细胞经50,100,200及500 KJ/m2剂量的长波紫外线辐射后12 h开始IL-6分泌均显著增加(P<0.05);与未加抗组胺药组相比,HaCaT细胞经200 KJ/m2辐射加入异丙嗪或(和)西咪替丁后24 h均可显著抑制IL-6的产生(P<0.05),且异丙嗪加西咪替丁组及异丙嗪组比西咪替丁组更显著(P<0.05)。结论长波紫外线辐射可刺激HaCaT细胞产生IL-6,抗组胺药可抑制这种作用。     

何首乌二苯乙烯苷抑制长波紫外线诱导的HaCaT细胞氧化损伤

目的探讨二苯乙烯苷对长波紫外线(UVA)辐射HaCaT细胞氧化损伤的保护作用。方法从何首乌中提取二苯乙烯苷。UVA辐射强度为18J/cm2,用人角质形成细胞HaCaT构建体外细胞模型。MTT法测定细胞活力;酶生化法测定胞质超氧化物歧化酶(SOD),GSH-px活性及MDA水平;人氧化应激与抗氧化PCR芯片检测细胞内氧化应激及抗氧化基因mRNA的变化,通过实时定量PCR验证芯片结果。结果在18J/cm2UVA辐射下,给定浓度范围内的二苯乙烯苷能剂量依赖性提高胞质SOD和GSH-px活力,降低胞质MDA水平;基因芯片检测发现二苯乙烯苷可明显改变部分氧化应激及抗氧化基因的表达,并通过实时定量PCR验证其结果与基因芯片结果一致。结论二苯乙烯苷对UVA辐射的HaCaT细胞氧化损伤有一定的保护作用。其机制与清除自由基、提高抗氧化酶活性及改变相关基因表达有关。     

当归多糖诱导HaCaT细胞凋亡的实验研究

目的从细胞凋亡的角度探讨当归多糖(APS)抑制HaCaT细胞增殖的机制。方法用细胞体外培养技术、台盼蓝拒染法与流式细胞术检测APS对HaCaT细胞增殖的影响,电镜观察细胞形态变化。结果细胞生长曲线显示25～2500mg/L的APS对HaCaT细胞有显著抑制作用,且呈剂量效应关系。流式细胞术结果显示250mg/L作用后S/G2+M期HaCaT细胞数减少,G0/G1期细胞增多。结论 APS对HaCaT细胞的增殖具有显著抑制作用,APS通过阻止HaCaT细胞进入S期而抑制其DNA合成。     

羟氯喹及没食子酸酯对HaCaT细胞光照射的影响

目的 探讨羟氯喹和绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)损伤永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)的保护作用及其机制。方法 采用UVB定时及定量照射培养的HaCaT细胞,分别加入羟氯喹和EGCG干预处理,以RT-PCR法检测各受试组p53、p21、c-fos基因表达水平。结果 UVB照射后可明显增加HaCaT细胞中p53,p21,c-fos mRNA表达,羟氯喹和EGCG可不同程度地下调上述基因表达水平。结论 羟氯喹和EGCG的光保护作用在HaCaT细胞可能与其抑制p53,p21,c-fos基因表达有关。     

中波紫外线诱导HaCaT细胞凋亡的研究

目的以不同剂量的中波紫外线(UVB)诱导体外培养的人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)凋亡,探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是否参与凋亡过程。方法取对数生长期的HaCaT细胞,分别用10 mJ/cm2,15 J/cm2,20 J/cm2,25 J/cm2,30 J/cm2的UVB照射,并于照射24 h后检测HaCaT细胞的增殖活性,分析HaCaT细胞的凋亡率,测定HaCaT细胞上清液中TNF-α的水平,观察细胞形态及凋亡细胞特征。结果在10~30 mJ/cm2的UVB照射下,随照射剂量的增大,细胞的增殖活性逐渐下降,而细胞的凋亡率逐渐增加,当剂量达30 J/cm2时,细胞凋亡率最大,细胞的增殖活性和凋亡率呈直线负相关;随UVB照射剂量的增大,TNF-α的分泌量增加,细胞上清液中TNF-α的分泌量和凋亡率呈直线正相关;倒置显微镜及透射电镜进一步从形态学上证实了细胞的凋亡改变。结论UVB可诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性;照射产生的TNF-α可能参与了其凋亡过程。     

中波紫外线诱导HaCaT细胞凋亡中TF-1细胞凋亡相关基因19的表达

目的：研究在中波紫外线(UVB）诱导正常永生化角质形成细胞(HaCaT）凋亡过程中，T细胞凋亡相关基因19(TFAR 19）的表达时相及位置，方法：使用流式细胞仪、膜联蛋白V(Annexin—V）、激光扫描共聚焦显微镜等方法进行研究。结果：在凋亡过程中，TFAR 19逐渐向核周聚积，最后向核膜内移位，在核膜及其周围以及核内表达。结论：在UVB诱导HaCaT细胞凋亡的早期和晚期过程中TFAR 19均有表达。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制长波紫外线诱导的HaCaT细胞氧化损伤和凋亡

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否能对长波紫外线(UVA)诱导的人角质形成细胞(HaCaT细胞)氧化损伤和凋亡起保护作用以及其可能的作用机制.方法:将HaCaT细胞分成空白组、EGCG组、UVA照射组以及UVA照射 EGCG组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,筛选最佳药物浓度;检测细胞上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量变化;流式细胞仪检测细胞膜电位变化;末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测不同组细胞凋亡率.结果:UVA照射组的SOD和GSH-Px明显下降、MDA相应上升,线粒体膜电位下降,凋亡率上升(P＜0.05).EGCG处理的细胞UVA照射后其活性以及上清液中的SOD、GSH-Px活性相对于未加药UVA照射组明显增加,MDA相应下降;线粒体膜电位上升,细胞凋亡率明显下降(P＜0.05).结论:EGCG可以减少UVA诱导HaCaT细胞氧化损伤和细胞凋亡.其机制可能与增强抗氧化成分活性和减少氧自由基有关.     

UVA辐射对HaCaT细胞分泌和表达趋化因子CXCL11/I-TAC的影响

目的 探讨UVA对IFN-γ和TNF-α诱导的HaCaT细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC的影响。方法 用ELISA检测不同剂量UVA（2、4、8 J/cm2）照射后培养24 h的HaCaT细胞上清中CXCL11/I-TAC分泌水平。用实时荧光定量PCR检测CXCL11/I-TAC mRNA表达水平。结果 正常培养的HaCaT细胞仅分泌和表达微量的CXCL11/I-TAC蛋白或mRNA。当用10 μg/L的IFN-γ和TNF-α联合刺激后,HaCaT细胞分泌或表达的CXCL11/ I-TAC显著升高。UVA在2、4、8 J/cm2呈剂量依赖性抑制CXCL11/I-TAC的分泌或表达。结论 UVA照射抑制角质形成细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC,从而在一定程度上降低了对Th1/Tc1细胞的趋化。     

贝伐珠单抗对HaCaT细胞凋亡及周期的影响

目的:评价贝伐珠单抗对HaCaT细胞凋亡的影响。方法:体外培养HaCaT细胞,不同浓度贝伐珠单抗分别作用:HaCaT细胞48 h后,Hoechst 33258荧光染色法观察贝伐珠单抗诱导HaCaT细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测贝伐珠单抗HaCaT细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:贝伐珠单抗处理HaCaT细胞48 h后,Hoechst 33258荧光染色显示细胞核染色质凝聚、边集、核裂解;流式细胞术检测结果显示细胞凋亡增加,G0/G1期细胞的比例增加。结论:贝伐珠单抗可诱导HaCaT细胞凋亡,同时可有效阻滞HaCaT细胞的周期进程,细胞周期被阻滞在G0/G1期。     

人乳头瘤病毒6/11型体外感染HaCaT细胞的研究

目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)6/11型病毒颗粒体外感染HaCaT细胞后的感染标志表达及检测方法。方法 从临床尖锐湿疣标本中提取HPV6/11病毒颗粒,用于感染单层培养的HaCaT细胞,以FQ-PCR监测病毒悬液与感染后HaCaT细胞的病毒DNA载量;用引物原位延伸标记方法原位检测感染后HaCaT细胞中HPV DNA的存在及分布;以免疫组化法检测HPV的衣壳抗原表达。结果 在病毒悬液中HPV DNA达到10~5拷贝/ml以上时,病毒处理后的HaCaT细胞FQ-PCR检测结果呈稳定阳性;PRINS方法可检测到呈灶状分布的胞核阳性染色的细胞;免疫组化法未能检测到HPV衣壳蛋白的表达。结论 一定浓度的HPV6/11可以在体外培养系统中感染HaCaT细胞,在其细胞核内出现HPV DNA,但无衣壳蛋白表达。     

维生素E亚微粒乳液对紫外线损伤角质形成细胞保护作用的研究

目的：研究维生素E亚微粒乳液（VitESME）对中波紫外线损伤永生化角质形成细胞HaCaT株的光保护作用。方法：高压均质法加微乳法制备VitESME,稀释后加入培养基中孵育HaCaT株,高效液相色谱法测定不同时段培养液中VitE含量;中波紫外线（UVB）照射HaCaT株,孵育24h后四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活性。结果：培养液中VitE含量在孵育8h后即明显下降,24h后已减少90％以上。VitESME孵育24h后细胞增殖较为明显,与对照组相比活性增加了44．22％。与非加药照光组相比,加药照光组孵育24h后细胞增殖活性在30mJ／cm^2,下降17．77％,在90mJ／cm^2下降40．42％。结论：VitE SME对细胞培养体系无毒性作用,且具有优良的释放性能和通透性。VitE SME对UVB照射的保护作用呈时间递增性;预先加入VitE SME可以部分减少紫外线介导的损伤。     

Differential modulation of stress-inflammation responses by plant polyphenols in cultured normal human keratinocytes and immortalized HaCaT cells

Background

Environmental and endogenous stresses to skin are considered causative reasons for skin cancers, premature ageing, and chronic inflammation. Screening of substances with preventive and/or curative properties is currently based on mechanistic studies of their effects towards stress-induced responses in skin cell cultures.

Objective

We compared effects of plant polyphenols (PPs) on the constitutive, UVA-, LPS-, or TNF-alpha-induced inflammatory responses in cultured normal human epidermal keratinocytes (NHEK) and immortalized HaCaT cells.

Methods

Representatives of three classes of PPs, flavonoids, stilbenoids, and phenylpropanoids were studied. Their effects on mRNA were determined by qRT-PCR; protein expression was assayed by Western blot and bioplexed ELISA; phosphorylation of Akt1, ERK1/2, EGFR, and NFkappaB was quantified by intracellular ELISA or Western blot.

Results

PPs or their combination with UVA or LPS induced strong up-regulation of stress responses in HaCaT but not in NHEK. In addition, compared to NHEK, HaCaT responded to TNF-alpha with higher synthesis of MCP-1, IP-10 and IL-8, concomitant with stronger NFkappaB activation. PPs down-regulated the chemokine release from both cell types, although with distinct effects on NFkappaB, Akt1, ERK, and EGFR activation.

Conclusion

Results of pharmacological screenings obtained by using HaCaT should be cautiously considered while extending them to primary keratinocytes from human epidermis.     

葡萄籽原花青素及UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响

目的 观察葡萄籽原花青素（GSPE）和长波紫外线（UVA）对人角质形成细胞（HaCaT细胞）增殖的影响,以探讨GSPE有无光保护作用。方法 MTT法分别测定不同浓度GSPE以及不同剂量UVA对HaCaT细胞增殖活性的影响。结果 GSPE浓度为5-200μg/m L时,对HaCaT细胞增殖影响不明显,浓度为500μg/m L及以上时抑制细胞生长,且有统计学意义;UVA剂量超过10 J/cm2有抑制作用且随剂量增高抑制作用越明显,且有统计学意义,25 J/cm2时其抑制率达37.65%;浓度为50、100μg/mL的GSPE对25 J/cm2 UVA照射后的HaCaT细胞的增殖有明显促进作用。结论25 J/cm2的UVA对HaCaT细胞的增殖有明显抑制作用,而合适浓度的GSPE对HaCaT细胞增殖活性有光保护作用。     

UVA induced darkening of lower epidermal cells as an in vitro system of immediate pigment darkening (IPD) and mechanisms of IPD

Immediate pigment darkening (IPD), which is a skin tanning reaction induced by UVA or visible light irradiation, is generally thought to result from photo oxidation of pre-existing melanin. Only a few in vitro systems useful for studying the detailed mechanisms have been developed. The purpose of this study is to present UVA-induced darkening at the cell level in an in vitro system and clarify the mechanisms of IPD. Human lower epidermal cells (LECs) separated by the Percoll density gradient centrifugation and murine B16 malignant melanoma cells (B16Cs) were treated to prepare a melanin containing, pyridine-insoluble precipitate (PUP). The degree of darkness of the UVA-exposed cells was expressed as reflectance at 400 nm (RE) from PUP. With increasing UVA dose, the RE from B16C-PUP induced no significant change, but the RE from LEC-PUP decreased. Thus the model of UVA-induced darkening at the cell level using LEC was successful. Measurement of the height of electron spin resonance (ESR) signal from PUPs of whole epidermal cells and of B16Cs revealed a 10% decrease in the former and no significant change in the latter after UVA treatment. These results suggest that a combination of the melanin in intracellular melanosomes and UVA exposure alone did not induce melanin darkening of IPD, and also that the semiquinoid form of melanin monomeric units decreased in the keratinocyte melanin. Taking into consideration the molecular structure of melanin, these results also suggest that photo oxidation of melanin monomeric units from the semiquinoid to the quinoid form is one of the mechanisms of IPD causing the darkening of melanin pigment.