成纤维细胞胶原合成及细胞内STAT6蛋白磷酸化与白细胞介素13的促进作用

目的:观察重组白细胞介素13对成纤维细胞3T3的胶原合成作用,及其在3T3细胞胞内的信号转导途径,探讨白细胞介素13促纤维化的作用机制。方法:实验于2005-03/2006-03在江西医学科学研究所江西省医学生物高技术重点实验室进行。将3T3细胞分为实验组和对照组,在进行实验前,两组细胞均用无血清DMEM培养12～16h,实验组加重组白细胞介素13(100 μg/L),作用24,48,72h后,应用胶原纤维特殊染色观察白细胞介素13作用下3T3细胞体外合成胶原纤维情况;上清液用羟脯氨酸试验检测细胞分泌的总胶原含量;用逆转录-聚合酶链反应检测3T3细胞白细胞介素13受体的表达;用免疫印迹技术检测白细胞介素13作用0,1,2,4h后STAT6蛋白磷酸化情况,组间比较采用t检验。结果:①实验组细胞胶原纤维合成增加及上清液分泌总胶原含量高于对照组(P<0.05)。②逆转录-聚合酶链反应检测到3T3细胞表达白细胞介素13受体α1。③免疫印迹技术检测到白细胞介素13作用1,2,4h均有磷酸化STAT6蛋白表达,且白细胞介素13作用2h磷酸化STAT6蛋白表达最强,4h衰减。结论:白细胞介素13受体α1在3T3细胞上表达,重组白细胞介素13促进3T3细胞胶原合成和STAT6蛋白磷酸化,可能在纤维化发病机制中发挥重要作用。     

溶血磷脂酸对人肺成纤维细胞白细胞介素13受体α2mRNA表达的影响

背景:白细胞介素13受体α 2与白细胞介素13结合后,不介导白细胞介素13功能,对白细胞介素13起负调控作用.有研究表明,溶血磷脂酸能增加人支气管上皮细胞白细胞介素13受体α 2的表达,从而抑制白细胞介素13的作用.目的:验证溶血磷脂酸对人肺成纤维细胞白细胞介素13受体α 2 mRNA表达的诱导作用.设计、时间及地点:mRNA水平的观察对照实验,于2007-07/2008-11在南昌大学医学院和江西省医学生物高技术重点实验室完成.材料:人肺成纤维细胞HFL-1购于中科院上海生化和细胞生物研究所.方法:培养HFL-1细胞,行时间依赖和剂量依赖实验.时间依赖实验采用1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激细胞,分别于0,6,12,24 h收集细胞.剂量依赖实验分别用0,0.1,1,10 μ mol/L的溶血磷脂酸刺激细胞,12 h收集细胞.主要观察指标:显微镜下观察溶血磷脂酸对HFL-1细胞生长的影响,提取HFL-1细胞总RNA,用反转录-聚合酶链反应及图像分析法剑测溶血磷脂酸对HFL-1细胞白细胞介素13受体α 2 mRNA表达的影响.结果:溶血磷脂酸不影响HFL-1细胞生长.1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激HFL-1细胞,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达增高,并呈时间依赖性.随着溶血磷脂酸浓度的增加,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达明显增加.1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激HFL-1细胞,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达可达高峰.溶血磷脂酸对HFL-1细胞白细胞介素13受体α 1 的表达无影响.结论:溶血磷脂酸能促进人肺成纤维细胞HFL-1白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达.     

人角膜基质成纤维细胞分泌作用与脂多糖的影响

背景:体外培养的角膜基质成纤维细胞,可以识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖,并释放多种细胞因子和趋化因子,从而促进角膜溃疡的形成.目的:观察细菌脂多糖对角膜基质成纤维细胞分泌作用的影响.方法:体外培养人角膜基质细胞,取第3～5代细胞鉴定后用于实验.采用ELISA法检测角膜基质细胞脂多糖作用前后培养上清中分泌白细胞介素1,肿瘤坏死因子α,白细胞介素6,白细胞介素8水平.结果与结论:脂多糖在一定质量浓度范围及作用时间内,对人角膜基质细胞增殖存活率没有影响.培养的人角膜基质成纤维细胞不表达白细胞介素1,肿瘤坏死因子α,未给予脂多糖的角膜基质细胞微量表达白细胞介素6,白细胞介素8,脂多糖(100 μg/L)作用24 h后,白细胞介素6,白细胞介素8水平明显增高.     

胶原膜和聚乳酸-羟基乙酸共聚物对成纤维细胞分泌细胞因子的影响

目的:细胞因子中白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素8的分泌对加速创面愈合有重要作用,实验观察两种不同类型的组织工程皮肤生物支架材料胶原膜和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)对成纤维细胞分泌细胞因子的影响,探讨两种生物材料在创面愈合中的生物活性。方法:实验于2005-05/2007-02在福建省烧伤研究所完成。以密度为2×107/cm2的成纤维细胞接种于胶原膜和PLGA上,以相应的单层细胞培养为对照组,于第7和14天扫描电镜下观察细胞生长状况;在培养第1,3,5,7,14天收集细胞培养上清液,用ELISA法检测上清液中白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素8的水平;同时检测乳酸脱氢酶水平来反映细胞损伤程度。结果:①扫描电镜下所见:培养第7天,成纤维细胞黏附于胶原膜和PLGA上呈三维生长;培养第14天,细胞突起形成并锚定于胶原膜和PLGA上,相互交错排列形成网状铺于胶原膜和PLGA表面或延伸进入间隙中,并有大量纤维丝状细胞外基质生成。②乳酸脱氢酶水平:各组各时相点无显著性差异(P>0.05)。③成纤维细胞分泌细胞因子比较:胶原膜组第1~7天白细胞介素6水平高于对照组(P<0.01~0.05),而PLGA组则于第3和5天白细胞介素6水平高于对照组(P<0.01);胶原膜组和PLGA组中第1~5天和第14天白细胞介素8水平高于对照组(P<0.01~0.05);胶原膜组和PLGA组中白细胞介素1β水平略高于对照组,但无统计学意义(P>0.05);胶原膜组和PLGA组两组间各时相点各细胞因子水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:胶原膜和PLGA均是良好的组织工程皮肤生物支架材料,对成纤维细胞无毒副作用,能促进成纤维细胞分泌某些细胞因子,为创面的修复提供有利的环境。     

大蒜素对牙龈成纤维细胞胶原代谢的影响

目的:体外评价大蒜素对人牙龈成纤维细胞(HGF)胶原代谢的影响。方法:将不同浓度大蒜素加入体外培养的HGF48h后,细胞免疫荧光化学方法检测细胞内Ⅰ型胶原含量;化学比色法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。结果:大蒜素在一定浓度范围导致HGF胞浆内Ⅰ型胶原合成显著减少、细胞上清液中胶原蛋白含量显著降低(P<0.05)。结论:大蒜素对体外培养的HGFⅠ型胶原合成及胶原分泌有抑制作用,提示大蒜素有防止牙龈纤维化的作用。     

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达

背景:尽管目前研究将骨髓间充质干细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白高表达作为细胞向某一方向分化的重要标志,但未分化的骨髓间充质干细胞是否表达该类蛋白目前尚无定论.目的:观察分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-10/2008-05在广东药学院完成.材料:ICR小鼠3只,1 d龄ICR乳鼠1只,由广东省医学实验动物中心提供.方法:利用差速贴壁法体外分离纯化小鼠骨髓间充质下细胞,待细胞至70%～80%融合时传代.取1 d龄ICR乳鼠皮肤组织,自行分离传代并冻存,经复苏后获得乳鼠皮肤成纤维细胞.实验组将稳定传代3次的小鼠骨髓间充质干细胞接种到6孔培养板中,按109L-1密度接种,1 mL/孔;对照组同法接种乳鼠皮肤成纤维细胞,培养72 h.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态及生长情况,RT-PCR法检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达.结果:原代培养的小鼠骨髓间允质干细胞集落形成初期,细胞核较大,胞浆较少,细胞呈三角形、多角形和长梭形等多科形态;传代后细胞生长旺盛.多数呈长梭型,细胞表面有大量微绒毛.培养48 h时,实验组无Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达,对照组表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原;培养72 h时.实验组Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达芾显著低于对照组(t=42.692,85.349,P＜0.01). 结论:传代培养48 h时,骨髓间充质干细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因尚未启动,至72 h后Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因出现低表达,其并非像成纤维细胞那样在生长过程中持续的表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因.     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

重建胶原纤维对细胞生长的影响

背景：胶原种类很多,而不同细胞只在特定类型的胶原环境中才表现出最佳的增殖和表型。目的：观察Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原对小鼠皮肤成纤维细胞、人牙周膜成纤维细胞和兔软骨细胞生长的影响。设计、时间及地点：对比观察,细胞学体外实验,于2007-09/2008-09在四川大学生物材料工程研究中心胶原研究室完成。材料：自制达到中试水平的猪皮Ⅰ型胶原和猪软骨Ⅱ型胶原。方法：分别将3种细胞在猪皮Ⅰ型胶原和猪软骨Ⅱ型胶原环境中进行体外培养,比较不同细胞在材料上的行为差异。主要观察指标：傅里叶变换红外光谱、示差扫描热分析和凝胶动力学分析比较2种胶原的热变性温度及在结构和性质上的差异;MTT法观察细胞在2种胶原环境中的黏附、增殖情况。结果：猪软骨Ⅱ型胶原和猪皮Ⅰ型胶原的热变性温度分别为105.8,87.5℃,2种胶原的官能团区相似。凝胶化曲线的对比中猪皮Ⅰ型胶原的成纤维过程较猪软骨Ⅱ型胶原迅速。MTT值显示细胞生长初期,小鼠皮肤成纤维细胞在软骨Ⅱ型胶原环境表现了较好的黏附性,但是更适于在猪皮Ⅰ型胶原上生长;人牙周膜成纤维细胞与小鼠皮肤成纤维细胞对胶原纤维的反应恰好相反。兔软骨细胞第2天在两种胶原上的黏附相似,第4天时在猪软骨Ⅱ型胶原环境中表现出较大的细胞生长密度。结论：不同细胞对Ⅰ,Ⅱ型胶原纤维表现了不同的时间依赖性,但猪软骨Ⅱ型胶原环境更接近于软骨生长的真实环境,更有利于软骨细胞朝特定方向分化,使软骨细胞维持稳定的表型。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型的改变

背景:近年来的研究表明,血管外膜成纤维细胞在血管损伤后新生内膜的增生中起重要作用,但对于引起血管外膜成纤维细胞表型转化的机制尚不十分清楚.目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变,同时检测对Ⅰ胶原蛋白表达的作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-07/2008-10在上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成.材料;鼠龄2个月的健康雄性SD大鼠,体质量约120 g,用于体外培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;转化生长因子β1由美国GenWay Biotech公司提供;罗格列酮粉剂为北京高盟化工有限公司产品.方法:实验分为3组:转化生长因子β1诱导组:以不同质量浓度的转化生长因子β1(3,5,10,15 μg/L)诱导成纤维细胞48 h;罗格列酮干预组:用不同浓度的PPAR-γ激动剂罗格列酮(5,10,30,50 μmol/L)干预成纤维细胞45 min后,加入转化生长因子β1 10 μg/L共同培养48 h:对照组:不添加任何干预措施.主要观察指标:①免疫组织化学α-平滑肌肌动蛋白检测不同浓度转化生长因子β1、罗格列酮干预后成纤维细胞的表型改变.②蛋白免疫印迹检测成纤维细胞中平滑肌α2肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:不同质量浓度转化生长因子β1诱导成纤维细胞48 h后,与对照组相比,5μg/L转化生长因子β1可明显刺激成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达,10μg/L转化生长因子β1刺激细胞表型改变及平滑肌α 2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达最明显(P<0.05),随后转化生长因子β1再增加至15μg/L,与10μg/L转化生长因子β1浓度组相比,其刺激细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达不再增加(P>0.05).不同浓度罗格列酮干预10 μg/L转化生长因子β1诱导的成纤维细胞48 h后,与对照组相比,30 μmol/L可明显抑制成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达(P<0.05).结论:PPAR-γ激动剂罗格列酮能抑制转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达.     

金属钴、铬离子对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达功能的影响

目的观察钴、铬离子对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)的细胞毒性及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响,探讨钴、铬离子对骨代谢功能的影响机制。方法钴、铬离子分别与小鼠成骨样MC3T3-E1细胞体外培养,噻唑蓝(MTT)法测定细胞活力。ELISA法检测培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白含量、RT-PCR检测成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白m RNA的表达。结果 MTT结果显示,与对照组相比,钴、铬离子能明显抑制成骨细胞的细胞活力;成骨细胞暴露在钴铬离子下,与对照组相比,24h、48h后:Ⅰ型胶原蛋白的分泌分别下降45.3%、49.2%(P0.05);Ⅰ型胶原蛋白m RNA表达分别下降26.8%、32.6%(P0.05)。结论钴、铬离子可抑制成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的分泌及其m RNA的表达,提示其对MC3T3-El细胞可能存在细胞毒性。     

胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原细胞相容性比较

背景:因心脏结构高度复杂、心肌组织有很高的机械顺应性,心肌组织工程对材料的要求高.以往研究表明Ⅰ型胶原和胶原海绵材料均适宜心肌细胞生长及分化.目的:拟进一步对比观察胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原与骨髓间充质干细胞的相容性,为心肌组织工程选择更理想的载体材料.设计、时间及地点:在解放军第四军医大学西京医院心血管内科实验室2007-03/10完成对比观察设计的实验.材料:胶原海绵由上海其胜制剂有限公司提供;温敏型Ⅰ型胶原由第四军医大学组织工程中心提供.方法:将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分别复合于胶原海绵和温敏型l型胶原材料,共同培养7 d,分别于培养第1,3,5和7天取材.主要观察指标:扫描电镜和苏木精.伊红染色观察骨髓间充质干细胞细胞形态及附着情况;MTT检测骨髓间充质干细胞细胞增殖情况.结果:①扫描电镜检测显示温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞黏附优于胶原海绵材料,细胞在Ⅰ型胶原材料中生长连接成片,表面有大量分泌颗粒.②MTT检测表明在培养第1,3,5,7天温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞活性(吸光度值)及细胞分裂增殖速度均高于胶原海绵材料(P＜0.01).结论:温敏型Ⅰ型胶原体外与骨髓间充质干细胞的相容性优于胶原海绵.     

Immunoassay techniques for the detection of circulating antibodies to collagen following the use of collagen medical devices

During the use of collagen medical devices, some adverse clinical reactions occur involving both the cellular and humoral types of the immune response. Thus, the development of immunoassay techniques for measuring the presence and the levels of circulating anticollagen antibodies is required. The authors present their protocol: it is a solid phase radioimmunoassay using collagen coated on polystyrene microplates and labelled protein A as the tracer. An example of the application of the technique is described. Anticollagen antibodies were monitored in 586 patients undergoing bovine collagen implant therapy. In a retrospective study on 166 patients we found a good correlation between the presence of antibodies to collagen and cellular immune reactions such as a positive skin test or adverse clinical reactions after implantation. A prospective study on 420 patients showed that the pretreatment anticollagen serologic test can be useful as an adjunct to skin testing in the conservative management of patients desiring bovine collagen implant therapy. The use of this double test allowed avoidance of any major clinical reaction and reduced minor signs of intolerance.     

Studies on the formation of collagen. III. Time-dependent solubility changes of collagen in vitro

Precipitation (or gelation) of collagen from cold neutral salt solution induced by warming was shown to be reversible on subsequent cooling. The degree of reversibility of heat precipitation rapidly diminished with time of incubation at 37°C. For calf skin collagen (acetic acid-extracted) and guinea pig skin collagen (crude NaCl extract) in neutral salt solutions (Γ/2 = 0.45) roughly 90 per cent of newly formed gel redissolved on cooling at 2°C.; less than 20 per cent redissolved on cooling gels previously maintained at 37°C. for 24 hours. At physiologic ionic strength the same preparations exhibited much more rapid development of irreversible precipitation, but the same time dependence was clearly evident. Highly purified collagen from crude saline extracts of guinea pig skin exhibited the same phenomenon although the quantitative aspects were somewhat different.     

Immunologic characterization of the membrane-bound collagen in normal human fibroblasts: identification of a distinct membrane collagen

Collagen, the major extracellular matrix protein, is also a membrane protein. Two types of collagen are detected on the normal human fibroblast membrane in culture, type I collagen and a new immunologically and chemically distinct collagen, type M (membrane) collagen. Antibodies to type M collagen elicited complement-mediated cytotoxicity, which could be blocked by pretreatment of the cells with bacterial collagenase or the antibody with type M collagen. Pretreatment of the cells with other proteolytic enzymes or the antibody with type I collagen or type III collagen had no effect on this complement-mediated cytotoxicity. Although type I collagen is the major collagen synthesized by normal human fibroblasts type M collagen may be the major cell membrane collagen and may be a major cell membrane component.     

Direct measurement of the platelet:collagen interaction by affinity chromatography on collagen/Sepharose.

A method for studying the platelet:collagen interaction is described that permits simultaneous measurement of platelet adhesion to collagen and the collagen-initiated release reaction. Plasma-free platelets are passed through short columns composed of polymeric collagen covalently linked to agarose (Sepharose 2B). EDTA (0.3 mM) is used to prevent platelet aggregation. 14C-Serotonin is used to measure the extent of the release reaction. Measurement of adhesion is based upon 51Cr. In the experiments that are described, the extents of both adhesion and serotonin release were a function of the total collagen content of the column and of the number of platelets applied. Up to 100 per cent of the applied platelets adhered to the columns. As much as 70 per cent of the platelet serotonin was released. Intracellular 51Cr, lactate dehydrogenase, and pyruvate kinase, on the other hand, were not lost from the platelets. Plasma-free platelets were prepared by two different techniques: gel filtration and differential centrifugation. Both preparations gave the same results. The influence of the column temperature was also examined. At temperatures below 37 degrees C., there was a sharp drop in serotonin release, but only a slight decline in platelet adhesion to collagen. Our results suggest that the collagen/Sepharose assay system should provide a usable and greatly needed technique for studying the molecular basis for the platelet:collagen interaction for assessing platelet function in abnormal states and for investigating the mechanism of action of potential inhibitors.