应用酵母双向杂交系统筛选和鉴定P75NGFR作用的蛋白

目的：探讨Ｐ７５ＮＧＦＲ介导神经细胞凋亡的分子机制。方法;以转染了Ｐ７５ＮＧＦＲ的大鼠小脑神经细胞株Ｒ２Ｌ２为细胞模型,应用酵母双向杂交系统（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）筛选和鉴定Ｐ７５ＮＧＦＲ胞内区Ｐ７５ＩＣＤ作用的蛋白。结果：和Ｐ７５ＮＧＦＲ作用的蛋白由一个６００ｂｐ大小的ＣＤＮＡ片段编码。结论：该工作将有助于探讨Ｐ７５ＮＧＦＲ介导细胞凋亡的分子机制和信号,为勃勃系统退行性病变的病因、     

新的锌指蛋白Mip1的DNA结合序列的筛选

目的 筛选一个新的锌指蛋白Mipl的DNA结合位点。方法 将Mipl cDNA全长克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1构建了Mipl的原核表达质粒pGEX—Mipl。用谷胱甘肽亲和层析纯化GsT—Mipl融合蛋白。通过固定化的GST-Mipl,从寡核苷酸文库中俘获Mipl的结合的寡核苷酸片段;将所得寡核苷酸片段插入T-载体,通过测序、序列比对得到DNA结合位点。结果锌指蛋白Mipl的融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达,能与固定化还原性谷胱甘肽很好地亲和而得到纯化;用固定化的Mipl融合蛋白俘获到了其结合的寡核苷酸序列,通过测序、序列比对,得到了Mipl的DNA结合位点。结论Mipl的DNA结合位点的核心序列为G／TCCTA,Mipl的DNA结合位点的成功确定为Mipl功能的深入研究打下了基础。     

利用酵母Two-hybrid系统筛选编码产物与p53相作用的人类基因

用酵母ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ系统在人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中寻找编码产物与ｐ５３相互作用的基因。在１．５×１０６个转化子中筛选到６８个初级阳性克隆。通过测定转化子第二轮β－半乳糖苷酶活力发现,人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中有一个阳性克隆中的ｃＤＮＡ编码产物与ｐ５３反应结果为明显阳性,说明两个蛋白之间存在较强的相互作用。用热测序法测得这段ｃＤＮＡ的序列通过查询基因数据库发现,这段ｃＤＮＡ编码人的泛肽交联酶,可认为是泛肽交联酶参与ｐ５３在细胞内浓度的调节。     

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的：随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17（Sp17）特异性结合的短肽序列,并进行鉴定.方法：以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛.富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析.结果：随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRMII、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMRIMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRRIRKQ.结论：从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列.     

外周血S100钙结合蛋白、Hcy及神经元特异性烯醇化酶水平与创伤性颅脑损伤患者颅内血肿吸收情况及认知功能的相关性分析

目的：探究外周血S100钙结合蛋白、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)及神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)水平与创伤性颅脑损伤患者颅内血肿吸收情况及认知功能的相关性。方法：选取2018年1月—2020年12月南京医科大学附属逸夫医院收治的74例创伤性颅脑损伤患者为观察组,同期于本院体检的75例健康人为对照组,比较两组外周血S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平;根据血肿吸收情况和是否发生认知功能障碍,将观察组分为吸收良好组、吸收不良组或有认知功能障碍组、无认知功能障碍组,分别比较各组间S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平,分析观察组血肿吸收情况、认知功能与外周血S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平的相关性。结果：观察组S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平明显高于对照组;吸收良好组血清中S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平明显低于吸收不良组;血清内S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平互为正相关,且均与血肿吸收水平呈负相关,即血肿吸收越好,血清内指标越低;有认知功能障碍组血清中S100钙结合蛋白、Hcy及NSE 水平明显高于无认知功能障碍组;认知功能障碍和血清内S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平均呈正相关,差异均有统计学意义 (P ＜ 0.05)。结论：创伤性颅脑损伤患者血肿吸收情况和认知功能与外周血中S100钙结合蛋白、Hcy及NSE水平具有明显的相关性,有助于该病的临床诊治。     

青蒿琥酯对非酒精性脂肪炎大鼠肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 和固醇调节元件结合蛋白-1c 表达的影响

目的：探讨青蒿琥酯对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和固醇调节元件结合蛋白原1c（SREBP-1c）表达的影响。方法采用高脂饲料喂养的方法复制大鼠NASH模型,实验分正常组、模型组、易善复组、青蒿琥酯低剂量组、中剂量组和高剂量组。正常组每天予以标准饲料喂养,正常组和模型组给予同等剂量的生理盐水。给药治疗8周后,提取肝组织,运用免疫组化方法测定各组大鼠肝组织PPARγ、SREBP-1c 蛋白表达情况;采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量;采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）含量;采用分光光度法测定谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）含量;光镜观察肝脂肪变、炎症及纤维化程度。结果与正常组相比,在模型组中不仅PPARγ蛋白表达（1.67±1.01）明显减少,而且SREBP-1c蛋白表达（3.27±1.03）明显增多（均P〈0.01）;青蒿琥酯低中剂量组与模型组相比,PPARγ蛋白表达增多,SREBP-1c蛋白表达明显减少,并且呈剂量依赖性（均P〈0.05）,青蒿琥酯高剂量组PPARγ为（3.21±1.02）,SREBP-1c为（1.32±0.77）,与模型组相比,差异均有高度统计学意义（P〈0.01）。与模型组相比,青蒿琥酯各剂量组能提高SOD和GSH-Px的含量,降低MDA的含量,并且呈剂量依赖性（均P〈0.05）;青蒿琥酯能明显改善大鼠肝组织脂肪变、炎症程度和肝纤维化程度。结论青蒿琥酯治疗大鼠NASH的机制可能与上调PPARγ和下调SREBP-1c的表达有关。     

酵母双杂交筛选与人巨细胞病毒US28相互作用的蛋白

目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒US28蛋白相互作用的宿主蛋白,可为研究US28蛋白的作用机制提供依据。方法构建p GBKT7-US28诱饵重组载体,检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用,然后利用酵母双杂交系统筛选人脑文库中与US28相互作用的蛋白质。对获得的阳性克隆进行PCR鉴定、测序及序列比对分析,并通过酵母共转化实验再次确认蛋白的相互作用。结果 p GBKT7-US28在酵母中成功表达US28融合蛋白;酵母双杂交筛选并验证,获得了5个与US28蛋白相互作用的宿主蛋白。结论初步鉴定得到5个与US28相互作用的细胞蛋白,为探索US28蛋白的新功能以及揭示巨细胞病毒的致病机理和疾病治疗奠定基础。     

用酵母双杂交技术筛选DND1相互作用蛋白

目的:小鼠睾丸生殖细胞瘤易感蛋白DND1是在进化中保守的RNA结合蛋白.为了进一步了解DND1的功能,我们筛选了与DND1相互作用的蛋白.方法:采用酵母双杂交系统,用Dnd1基因编码序列构建诱饵载体筛选小鼠10.5天的胚胎文库.结果:筛选小鼠胚胎cDNA文库得到4个与DND1相互作用蛋白,分别为Tun蛋白、辅肌动蛋白α...     

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白，为该基因的功能研究提供线索。方法：构建AngRem104的真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c—myc，转化酵母菌AH109，Western blot证实蛋白表达，进行毒性和自激活检验，与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合，筛选与AngRem104相互作用的蛋白。结果：AngRem104蛋白能在酵母中正常表达，对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子1α1、糖皮质激素受体AF-1特异延伸因子、β2-微球蛋白、巴戴-比德尔综合征2蛋白及4个与细胞代谢有关的蛋白。结论：AngRem104可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢，并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem104的功能研究提供了重要线索。     

酵母双杂交技术筛选胞内氯离子通道蛋白1结合蛋白

目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7-CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用α-gal检测阳性克隆。所获得阳性克隆测序后进行BLAST检索。结果用酵母双杂交方法筛选到了16个阳性克隆,其中有4个是已知蛋白的基因。结论利用酵母双杂交系统筛选到了数个结合蛋白。