shRNA沉默HBx下调HepG2.2.15细胞基质金属蛋白酶2的表达

目的探讨HBx小发夹RNA(shRNA)对HepG2.2.15细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响。方法采用psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞,反转录PCR评估沉默效率;MTT法检测转染后HepG2.2.15细胞增殖情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测MMP-2 mRNA表达;Western blot法检测MMP-2蛋白表达的变化。结果反转录PCR检测HBx基因的沉默效率为53.6%;MTT检测结果显示转染24、48、72 h后HepG2.2.15细胞的增殖受抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后,qRT-PCR和Western blot检测结果显示,HepG2.2.15细胞中MMP-2基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 RNA干扰技术抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,可抑制细胞增殖,下调HepG2.2.15细胞中MMP-2的表达。     

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2.2.15细胞中的表达

目的 初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制.方法 用RT-PCR及Real-time PCR检测HepG2.2.15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异.构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒,分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性.结果 在mRNA水平上,DNAJB4在HepG2.2.15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2.59倍,且二者有显著性差异(P＜0.01).DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2.28倍.转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2.11倍和1.77倍,而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响.结论 在HepG2.2.15细胞中,HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达,其中HBs和HBc蛋白起主要作用.     

低氧及HIF－1α基因转染对HepG2细胞基因表达谱的影响

 目的：应用基因芯片技术,研究缺氧及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因转染对HepG2细胞基因表达谱的影响。方法: 以常氧对照腺病毒(Ad-GFP)转染组（CC组）为对照组,常氧HIF-1α腺病毒(Ad-HIF)转染组（CH组）、低氧对照腺病毒(Ad-GFP)转染组（HC组）、低氧(2%O₂, 24 h) HIF-1α腺病毒(Ad-HIF)转染组（HH组）为实验组,提取HepG2细胞的总RNA,反转录成Cy3和Cy5标记的cDNA探针,与定制的包含1 628个能量代谢相关基因的cDNA芯片进行杂交,筛选出实验组与对照组差异表达基因并进行分析。结果: 与常氧对照腺病毒转染组相比较,常氧HIF-1α腺病毒转染组3个基因表达下调;低氧对照腺病毒转染组10个基因表达上调;低氧HIF-1α腺病毒转染组6个基因表达上调、1个基因表达下调。这些差异表达基因编码蛋白的功能涉及能量代谢、信号转导、细胞凋亡、转录和HIF-1调节、生物转化、酸碱平衡调节、细胞黏附分子等方面。结论: 低氧可以上调HepG2细胞能量代谢相关基因表达,HIF-1的转录调节作用可能是其重要环节。     

基因芯片分析筛选BEL-7402与BEL-7402/FU细胞中的差异miRNA表达基因

目的:探讨2种肝癌细胞BEL-7402细胞及BEL-7402/FU细胞中差异表达的miRNA并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法:采用TRIzol一步法提取BEL-7402细胞及BEL-7402/FU细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子Hy3标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用Genepix Pro 6.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,然后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果:在333个基因表达谱的筛选中,发现有2个基因表达水平显著上调,331个基因表达水平显著下调.结论:miR-122,miR-195等基因组对表达肝癌细胞耐药基因表达谱有显著的影响,可能参与肝癌耐药的发生、发展.     

新型低密度cDNA Macroarray的建立及其应用于干扰素抗HBV的研究

目的了解人肝胚瘤细胞株HepG2和稳定转染HBV全基因组细胞株HepG2.2.15的干扰素(IFN)抗病毒基因表达谱。方法选择与IFN抗病毒及其信号转导途径相关的288个IMAGE克隆,经聚合酶链反应(PCR)扩增相应的基因片段,将扩增的DNA片段纯化后点样于阳离子尼龙膜上以制备成人工芯片。HepG2和HepG2.2.15细胞经IFN处理后,分离细胞总RNA,进行逆转录并且同时以32P标记;将标记的cDNA靶基因与尼龙膜上的探针进行分子杂交。经Cyclone扫描系统和OptiQuantTM软件处理,将图像信号转换成数据信息;再经Excel软件分析、处理形成Macroarray数据值。结果Macroarray分析提示,在HepG2和HepG2.2.15细胞仅有部分IFN诱导基因表达,多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。通过比较HepG2和HepG2.2.15细胞,发现两者表达IFN诱导基因有差异,即对IFN应答有差异。进一步分析还发现,尽管与HepG2细胞存在差异的IFN应答,HepG2.2.15细胞的IFN信号转导途径(JakSTAT途径)却是开放的、未受损伤的。结论HepG2和HepG2.2.15细胞具有差异的IFN抗病毒基因表达谱。     

Lovastatin对肝癌HepG2细胞作用后基因差异表达的初步研究

目的： 用cDNA芯片观察lovastatin作用前后HepG2细胞的差异表达基因。 方法： 20 μmol/L的lovastatin作用于HepG2细胞18 h，各提取实验组与对照组细胞总RNA，用cDNA直接标记法制备探针，进行杂交，杂交信号经扫描后，用软件分析基因表达情况。应用RT-PCR验证部分差异表达基因。 结果： Lovastatin作用后表达上调的基因有30个，表达下调的基因有11个，涉及信号转导、肿瘤免疫、细胞周期等方面，RT-PCR结果符合基因芯片结果。 结论： 用基因芯片筛选出的lovastatin作用后的肝癌细胞差异表达基因为深入研究他汀类药物的抗肿瘤机制提供重要的理论依据。     

榄香烯或热休克对人肝癌细胞HepG2HSP70膜表达及多种HSP基因表达的影响

目的 :研究榄香烯或热休克对人肝癌细胞HepG2 HSP70膜表达及多种HSP基因表达的影响。方法 :免疫荧光和FCM观察榄香烯 (5 0 μg ml,1h)或热休克 (42℃ ,1h)处理后肿瘤细胞HSP70的膜表达 ,放线菌素D阻断基因转录。应用人类基因表达谱芯片分析经榄香烯或热休克处理的人肝癌细胞HepG2 多种热休克蛋白基因及与热休克蛋白调控相关基因表达谱的改变。结果 :榄香烯或热休克处理 1h后 ,肿瘤细胞膜表面HSP70的表达均有增高 ,而以榄香烯处理为明显 ,放线菌素D的加入在两种处理中均增高了HSP70膜表达的阳性率。两种处理均使细胞的HSP70HP(EnhancerProtein)基因表达增高 ,而以热休克处理为更明显 ,HSPA2的表达均有所下降 ,也以热休克处理更明显 ,HSF1基因在热休克处理为上调 ,而在榄香烯处理则为下调 ,与肿瘤免疫密切相关的HSP70、HSP72、HSP75及HSP90、gp96基因的表达则没有变化。结论 :榄香烯较热休克处理早期能更多地促进HepG2 细胞HSP70的膜表达 ,其机制可能是与其改变胞内已存在的HSP70的分布 ,和 或促进HSP70mRNA的翻译有关。两种处理均能改变与HSPs调控相关基因的表达 ,并可引起HSPA2基因表达下调。     

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的 构建针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA（short interfering RNA）表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法 设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论 载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.     

乙型肝炎病毒E抗原肝细胞作用蛋白AK026018表达谱芯片的研究

目的 应用基因芯片技术,筛选能被乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg）肝细胞作用蛋白AK026018反式调节的靶基因,初步研究该蛋白的生物学功能.方法 应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因,构建真核表达载体,转染肝母细胞瘤系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果 经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确.在8464个基因表达谱的筛选中,发现有122个基因有差异表达,其中78种基因表达水平显著下调,45种基因表达水平显著上调.结论 成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因AK026018的反式调节蛋白,证明该基因对于肝细胞基因表达谱有显著影响.     

伤寒减毒活疫苗Ty21a免疫前后小鼠肠细胞差异表达的基因

以基因表达谱芯片对Ty2 1a免疫前后小鼠肠细胞 (包括肠粘膜上皮细胞和肠上皮间淋巴细胞 )基因表达的差异性进行研究比较。将 490条经抑制消减杂交法筛选出的与小鼠Ty2 1a免疫相关的cDNA制备成表达谱芯片 ;利用免疫前后小鼠肠细胞的mRNA通过逆转录方法 ,将Cy3和Cy5两种荧光分别标记到两种组织的cDNA上 ,制备成cDNA探针 ,并与表达谱芯片进行杂交及扫描 ,单点重复 2次实验 ,通过计算机数据处理判定基因是否在上述两种细胞群中有表达差异。筛选出差异表达基因共 98条 ,其中 92条为表达上调基因 ,6条为表达降低基因。提示 ,基因表达谱芯片技术是高通量进行基因表达模式研究的方法 ,可同时定量研究大量的基因表达水平 ,从而鉴定可能参与免疫的基因。