异种角膜脱细胞基质为供体进行角膜前板层移植的初步研究

目的探讨以异种猪角膜脱细胞基质为供体植片,分析兔角膜进行前板层移植后的生物相容性：设计实验研究。研究对象新西兰白兔。方法应用1％TritonX-100及冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,切取1／3厚度前板层作为供体角膜植片,对兔眼角膜前板层切除后进行移植,同时以新鲜猪角膜板层为供体对兔进行前板层移植作对照。通过术后角膜透明度、组织结构观察,评价猪角膜脱细胞基质的生物相容性及植片转归的情况。主要指标角膜透明度和组织学HE染色。结果制备的猪角膜脱细胞基质植片作前板层移植到兔眼后,未见明显的新生血管、炎症反应、角膜坏死等排斥现象,观察期内植片较透明;脱细胞基质表面上皮化良好,植片基质板层与植床逐渐融合,植片内有宿主细胞迁入生长,板层结构与正常角膜相似。结论猪角膜脱细胞基质具有良好的生物相容性、安全性和低抗原性,有望成为角膜板层移植的供体材料。     

猪角膜脱细胞基质的制备及生物相容性的实验研究

目的探讨猪角膜脱细胞基质（CACM）的制备方法，评价其组织学特性和生物相容性。方法应用1％TritonX-100去垢剂振洗，经冷冻干燥处理得到猪CACM，通过苏木精-伊红染色、扫描电镜观察行组织学检测。将猪CACM植入兔角膜板层间观察10周，取材做组织切片，评价其生物组织相容性。结果组织学检测证实角膜细胞完全脱净，胶原纤维排列疏松，板层结构同正常角膜；扫描电镜CACM表面未见细胞结构，纵切面上胶原板层间出现清晰的空穴状裂隙；CACM植入兔角膜层间后，观察期内未见明显排异反应。结论TdtonX．100可以有效地脱净角膜细胞，保存胶原排列的结构特征，经过冷冻干燥可形成多孔隙且胶原排列疏松的板层结构，适合作为载体材料，猪CACM与兔角膜生物相容性好。     

依地酸二钠-几丁糖凝胶对兔角膜血染铁离子析出的作用

目的研究依地酸二钠-几丁糖凝胶对体外角膜血染铁离子析出的作用。方法12只（24跟）健康新西兰大白兔,制作角膜血染模型后随机分为3组：生理盐水组、0．37％依地酸二钠（EDTA）组及0．37％EDTA—1．0％几丁糖组,每组8只角膜。将血染角膜平均分为两半,取一半角膜在各组浸泡前及浸泡35d后分别行Perl’s染色组织病理学观察,了解相应时间点血染角膜中铁离子分布情况。取另一半角膜分别浸泡在3组液体中,每5d取浸泡液测量铁离子析出浓度,共7次。结果0．37％EDTA-1．0％几丁糖组浸泡液中铁离子析出量在各时间点明显高于其他两组（P〈0．001）,且浸泡35d后的角膜上皮与其他两组相比仍较完整,基质水肿较轻,胶原板层排列仍较紧密。结论0．37％EDTA-1．0％几丁糖凝胶在体外促血染角膜中的铁离子析出作用明显优于生理盐水及0．37％EDTA滴眼液,且对角膜组织的结构无明显影响,有望用于临床上治疗角膜血染。     

异种角膜基质的研究现状及问题

在角膜3层(上皮层+Bowman's膜、基质层、内皮层+Descemet's膜)膜中,按等量计算,基质层的免疫原性是最低的.应用脱细胞的异种角膜基质移植后,神经和基质细胞可以再生,术后未见排斥反应,植片获得透明.因此,异种角膜基质有望成为板层角膜移植的供体和组织工程角膜的载体.现就异种角膜基质的研究现状及问题综述如下.     

以异种角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮-载体-内皮复合物的实验研究

目的探讨以异种角膜脱细胞基质为载体,体外构建生物角膜的可能性和方法。方法应用去垢剂1％TritonX-100冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,在其上皮面和内皮面分别接种兔角膜上皮细胞和内皮细胞,体外培养2周。将复合物制成组织切片,在光镜下观察组织形态（HE染色）,采用免疫组织化学方法检测角膜上皮特异性细胞角蛋白3（CK3）,使用锥虫蓝联合茜素红染色观察内皮细胞,在扫描电镜下观察上皮面和内皮面的超微结构。结果体外培养生物角膜获得上皮、无细胞基质和内皮三层复合结构。4或5层复层上皮中以扁平细胞为主,胞质内特异性CK3表达阳性;内皮层为一连续的单层扁平细胞,细胞活性良好,锥虫蓝联合茜素红染色显示组织呈典型的蜂巢样镶嵌结构。扫描电镜下观察,在载体的上皮面细胞呈复层样生长,形态近似扁平与梭形之间;内皮面为多边形单层细胞,表面具有微绒毛结构。结论构建的生物角膜为上皮一脱细胞基质载体一内皮复合物,初具角膜的雏形结构。异种角膜脱细胞基质提供了良好的细胞生长界面,有望成为体外构建角膜的载体材料。     

利用猪角膜脱细胞基质行板层角膜移植手术治疗感染性角膜炎的临床研究

目的 评价利用猪角膜脱细胞基质行板层角膜移植手术治疗感染性角膜炎的安全性和有效性.方法 采用前瞻性系列病例观察研究方法,纳入了2018年5月～2019年4月本院收治的感染性角膜炎15例(15眼),使用猪角膜脱细胞基质行板层角膜移植手术.观察指标主要包括感染控制情况、角膜透明度、新生血管形成、最佳矫正视力(BCVA)及并...     

医用几丁糖对角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用

目的观察医用几丁糖对角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用。方法NaOH烧伤兔角膜制作角膜碱烧伤模型,随机分为碱烧伤组（碱烧伤）和几丁糖组（碱烧伤＋2％医用几丁糖滴眼）。分别于1、4．7、14d观察两组兔角膜新生血管生长情况,HE染色计算多形核粒细胞（PMN）数量,兔疫组化染色测定血管内皮生长因子（VEGF）的活性。结果几丁糖组新生血管较碱烧伤组生长缓慢,PMN计数及VEGF表达较碱烧伤组均明显减少。结论医用几丁糖可抑制碱烧伤后角膜新生血管的形成。     

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。     

使用猪角膜脱细胞基质的人板层角膜移植治疗真菌性角膜炎的临床观察

目的:观察猪角膜脱细胞基质构建的生物角膜支架用于人角膜板层移植术治疗药物难以控制的浅层真菌性角膜炎的效果.方法:对2015-06/2016-03我院收治的16例16眼真菌性角膜炎患者的临床资料进行回顾性分析.16例真菌性角膜炎进行猪角膜脱细胞基质移植,术后随访6mo.对患者术后视力、角膜植片情况、并发症及复发情况进行分析.结果:术后7~10d植片角膜上皮化.16例病例术后1mo角膜水肿,1mo后角膜水肿消失,角膜逐渐透明.术后1mo有2例出现术眼角膜上皮缺损,药物治疗均恢复.术后出现眼压高3例,给予降眼压治疗后眼压控制.随访期间未出现角膜溶解、感染复发、排斥现象.术后1、3、6mo视力分别为1.27±0.22,1.11±0.13,0.79±0.22,术后视力均较术前明显提高,术后1mo视力与术前相比无统计学差异(P=0.06),术后3、6mo视力与术前相比具有明显统计学差异(P=0.01、0.001);其中术后3mo与术后1mo视力相比无明显提高,结果无统计学差异(P=0.11),而术后6mo视力较术后1、3mo均有明显提高,结果具有显著统计学差异(P<0.001).结论:猪角膜脱细胞基质移植治疗真菌性角膜炎是安全、有效的方法.     

异种角膜基质作为生物角膜载体的免疫学研究

目的探讨异种(猪)角膜基质组织免疫原性,以评价其作为角膜重建载体材料的可行性。方法将新鲜、脱水2种猪角膜基质植片分别植入F344大鼠角膜基质层间,术后12d、90d抽取外周血,行抗CD25·FITC和抗CD4/CD8·PE双色免疫荧光标记,流式细胞仪测定分析。结果测得新鲜组、脱水组大鼠术后12d外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.53%±0.47%,2.13%±0.53%与0·57%±0.20%,0.67%±0.18%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.28,1.69±0.18)与同基因移植组(1.78%±0.36%,1.50±0.19)、阴性对照组(2.06%±0.52%,1.44±0.32)比较无显著性差异(P>0.05)。术后90d,新鲜组、脱水组大鼠外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.48%±0.39%,1.50%±0.46%与0·55%±0.15%,0·58%±0·11%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.51,1.36±0.59)与同基因移植组(1.32%±0·75%,1.31±0.29)、阴性对照组(1.34%±0.18%,1.44±0.42)比较,也无显著性差异(P>0.05)。结论异种(猪)角膜基质免疫原性低,是一种理想的角膜体外重建载体材料。     

单纯去细胞猪角膜基质穿透性角膜移植治疗兔角膜溃疡

目的:探讨单纯去细胞猪角膜基质材料诱导兔自体角膜细胞再生及修复兔角膜溃疡的可行性.方法:新西兰白兔10只制作成角膜溃疡模型,接受单纯去细胞猪角膜材料的穿透性角膜移植术,排除发生手术并发症眼(2只),剩余8只术后进行大体观察(裂隙灯检查),观察植片透明度、新生血管、上皮修复情况.分别于3,6,8,16和24wk取材进行组织学观察,并取16wk兔行超声生物显微镜(UBM)检查、32wk兔行透射电镜检查.结果:角膜溃疡修复,眼表重建8只.初期角膜上皮反复糜烂,荧光素纳染色有荧光堆积,HE 组织学检查提示4wk时上皮细胞复层化.角膜基质细胞沿材料板层生长,排列规律;3～7d角膜缘新生血管发生,位于浅基质层,1～20d达高峰,深入植片或沿缝线环形生长,拆线后逐渐消退,32wk后闭锁仅余3～4支微血管;UBM提示角膜恢复自然曲率,植床与植片尚未修复完善.TEM 提示成纤维细胞分泌胶原原纤维,参与材料改建.结论:CACM支持细胞3D生长,促进自体细胞长入,参与角膜修复改建.     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

大鼠生物活性组织工程角膜等效物穿透性移植后观察

目的观察组织工程角膜等效物（tissue-engineered corneal equivalent,TECE）大鼠穿透性角膜移植后大体及组织病理学特点。方法脱细胞猪角膜基质（corneal acellular matrix,CACM）接种7dSD大鼠原代角膜上皮细胞与基质细胞,气液面培养4～6d至材料透明后作为TECE组植片,单纯CACM作为对照组植片,施行穿透性角膜移植术。术后观察角膜新生血管、植片混浊度、角膜细胞修复情况,2周、4周、8周、16周取材进行HE检查、20周取材进行透射电镜检查。结果TECE组术后10d角膜荧光素钠染色（-）,对照组术后14d角膜荧光素钠染色（-）;TECE组新生血管出现时间（5.00±1.22）d晚于对照组（3.80±0.84）d,差异有显著统计学意义（P〈0.01）,2周时TECE组新生血管面积（15.47±7.01）mm^2少于对照组（62.75±29.22）mm^2,差异有显著统计学意义（P〈0.01）。拆线后2组角膜新生血管均大部分消退,植片逐渐透明;20周透射电镜检查提示2组均有新胶原形成,TECE组有神经纤维长入。结论以CACM为支架构建的组织工程角膜等效物可以抑制角膜新生血管形成,透明度高,支持自体角膜细胞与神经纤维长入。     

角膜体外重建异种生物载体材料生物相容性研究

目的　研究异种 (猪 )角膜基质的生物相容性 ,评价其作为角膜体外重建载体的可行性。方法　将新鲜、脱水两种猪角膜基质分别植入新西兰白兔角膜层间 ,定期临床观察植片愈合情况 ,并于术后 2周、1、2、4、8个月取兔角膜进行组织学观察。结果　临床观察 :全部植片存活 ,12只术眼未见角膜水肿混浊、角膜新生血管、排斥反应发生 ,新鲜植片在 2个月左右已透明 ,脱水植片在 6个月后透明。组织学观察 :新鲜植片 4个月时与兔角膜基质相融愈合 ,脱水植片经角膜细胞再分布、胶原纤维改建重塑 ,于 8个月后与兔角膜基质相融愈合 ,2组植片愈合过程中未见有淋巴细胞浸润及新生血管生成。结论　异种 (猪 )角膜基质具有良好的生物相容性 ,是一种理想的角膜体外重建载体材料。     

壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展

利用组织工程技术构建组织工程角膜能够从根本上解决角膜移植供体不足和术后免疫排斥等问题.理想的支架材料是构建组织工程角膜的重要条件.壳聚糖及其衍生物具有良好的透明性、生物相容性、可降解性、力学性能和可塑性,在角膜组织工程中具有良好的应用前景.本文对壳聚糖及其衍生物在角膜组织工程中的研究现状进行了综述,讨论了目前存在的问题,为构建满足临床要求的组织工程角膜提供指导.     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

Acellular porcine corneal matrix as a carrier scaffold for cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts in vitro

AIM: To investigate the feasibility of corneal anterior lamellar reconstruction with human corneal epithelial cells and fibroblasts, and an acellular porcine cornea matrix (APCM) in vitro. METHODS: The scaffold was prepared from fresh porcine corneas which were treated with 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution and the complete removal of corneal cells was confirmed by hematoxylin-eosin (HE) staining and 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. Human corneal fibroblasts and epithelial cells were cultured with leaching liquid extracted from APCM, and then cell proliferative ability was evaluated by MTT assay. To construct a human corneal anterior lamellar replacement, corneal fibroblasts were injected into the APCM and cultured for 3d, followed by culturing corneal epithelial cells on the stroma construction surface for another 10d. The corneal replacement was analyzed by HE staining, and immunofluorescence staining. RESULTS: Histological examination indicated that there were no cells in the APCM by HE staining, and DAPI staining did not detect any residual DNA. The leaching liquid from APCM had little influence on the proliferation ability of human corneal fibroblasts and epithelial cells. At 10d, a continuous 3 to 5 layers of human corneal epithelial cells covering the surface of the APCM was observed, and the injected corneal fibroblasts distributed within the scaffold. The phenotype of the construction was similar to normal human corneas, with high expression of cytokeratin 12 in the epithelial cell layer and high expression of vimentin in the stroma. CONCLUSION: Corneal anterior lamellar replacement can be reconstructed in vitro by cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts with an acellular porcine cornea matrix. This laid the foundation for the further transplantation in vivo.