高压力对血管平滑肌细胞的形态、α-肌动蛋白和增殖细胞核抗原表达的影响--一种新的颈总动脉在体受力模型研究

为了研究机械应力在动脉重建中的作用和机制 ,本文建立了以压力改变为启动因素导致动脉重建的大鼠颈总动脉在体受力模型 ,并观察了高压力对血管平滑肌细胞 ( VSMCs)形态、α-肌动蛋白 ( α- actin)和增殖细胞核抗原 ( PCNA)表达的影响。以高压力 ( 160 mm Hg)和正常压力 ( 80 m m Hg)灌流大鼠颈总动脉 6h,组织学和免疫组织化学方法观察 VSMCs的形态、α- actin和 PCNA表达的变化。结果表明 ,大鼠颈总动脉在体受力模型在压力、脉压差和频率方面有较好的可控制性及稳定性 ;高压力使 VSMCs核常染色质增加 ,α- actin染色较正常压力组浅淡 ,表明 α- actin含量减少 ;PCNA表达阳性。大鼠颈总动脉在体受力模型的成功建立 ,为研究机械应力对动脉重建的作用提供了一种新的手段。高压力可诱导 VSMCs向合成型转换 ,细胞趋于增殖     

低切应力对动脉粥样硬化形成及血管平滑肌细胞α-肌动蛋白和c-Myc蛋白表达的影响

目的为探讨低切应力对颈总动脉粥样硬化形成及其血管平滑肌细胞增殖的影响，建立了低切应力颈总动脉粥样硬化模型；并观察了血管平滑肌细胞的α-肌动蛋白和c-Myc蛋白表达的变化。方法手术结扎家兔左颈外动脉，术后高脂饲料喂养。组织学和免疫组织化学方法观察粥样斑块的形成和α-肌动蛋白及c-Myc蛋白表达的变化。结果在低切应力颈总动脉粥样硬化模型中，颈总动脉较早出现明显粥样斑块，管壁增厚，管腔内径变小；颈总动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的α-actin含量减少、c-Myc表达增高。结论低切应力促进了动脉粥样硬化斑块的形成，促使粥样硬化动脉VSMC增殖能力增强。     

压力诱导大鼠颈总动脉即刻早基因产物c-Jun的表达

为了探讨压力在动脉重建中的作用机制 ,研究压力对动脉即早基因产物 c- Jun表达的影响。采用大鼠颈总动脉在体受力模型 ,以高压力 (16 0 mm Hg)和正常压力 (80 mm Hg)灌流颈总动脉 0 .5、1、3、6 h,免疫组织化学和计算机图像处理检测颈总动脉 c- Jun的表达。结果显示 ,正常压力作用下 ,1h组颈总动脉 c- Jun有少量表达 ,3h和6 h组有所增加。高压力作用 0 .5 h即可诱导颈总动脉 c- Jun的表达 ,随着时间的延长 ,c- Jun的表达与正常压力组相比有明显增加 (P<0 .0 1)。结果提示 ,压力可以诱导动脉 c- Jun的表达 ,这一机制可能在压力诱导动脉重建中起重要作用。     

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖中CaN活性及增殖细胞核抗原表达水平的影响

目的：观察川芎嗪对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）中钙调神经磷酸酶（CaN）活性及增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平的影响。方法：建立AngⅡ诱导VSMCs增殖模型，应用免疫细胞化学法观察血管平滑肌细胞PCNA表达；并用酶促反应定磷法测定CaN活性。结果：AngⅡ组能够明显刺激VSMCs增殖，VSMCs细胞数目和细胞增殖活度明显高于正常对照组（P＜0.01）；CaN活性和PCNA表达量（A值）显著高于正常对照组（P＜0.01）。同时加川芎嗪处理，各组CaN活性和PCNA表达水平均显著低于AngⅡ组（P＜0.01）。结论：川芎嗪对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用，其机制与抑制CaN介导的信号转导进而抑制PCNA的表达有关。     

高糖上调大鼠主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达

目的 探讨高糖对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）骨桥蛋白（OPN）表达的影响及机制。方法 SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素复制Ⅰ型糖尿病模型,免疫组化、RT-PCR和western blot检测大鼠主动脉OPN和PCNA的表达;大鼠主动脉VSMCs经含正常糖(5.5mmol/L)、高糖(25mmol/L)、甘露醇(25mmol/L)、高糖+GF109203X（蛋白激酶C抑制剂,10μmol/L),高糖+ NAC（N-acetyl-l-cysteine,NF-κB抑制剂,10μmol/L)的DMEM处理48 h,免疫荧光及western blot检测OPN的表达,western blot 分析PCNA、PKC和 p65的表达。结果 高糖血症大鼠主动脉VSMCs高表达OPN及PCNA。原代VSMCs经高糖刺激后OPN、PCNA、PKC及p65表达明显增加;GF109203X和NAC均可下调PCNA的高表达,但仅GF109203X抑制高糖诱导的OPN高表达。结论 高糖可能通过激活PKC信号诱导OPN表达并促进VSMCs增殖从而在糖尿病性血管并发症中起作用。     

半夏提取物通过AMPK/FOXO3a信号通路对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨半夏提取物（EP）对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖、凋亡的影响及作用机制。方法：采用卵清蛋白致敏和激发方式构建哮喘大鼠模型，分离并培养大鼠ASMCs，免疫荧光染色鉴定ASMCs中的α-肌动蛋白（α-actin），符合ASMCs特征后将ASMCs分为对照组、模型组、EP组、Compound C组、EP+Compound C组，MTT检测细胞增殖活性；流式细胞术检测细胞凋亡；ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-6、TNF-α水平；Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、叉头框蛋白O3a(FOXO3a)、p-FOXO3a蛋白表达。结果：免疫荧光染色显示98%细胞的细胞质中呈现绿色荧光的肌丝，α-actin呈阳性表达，证明培养的细胞为ASMCs。与对照组比较，模型组细胞OD490、CyclinD1、PCNA蛋白表达及上清中IL-6、TNF-α水平显著升高，细胞凋亡率、Bax、Caspas...     

一种可控性大鼠颈总动脉狭窄模型的建立及切应力测定

目的：为在体研究切应力改变诱导内皮细胞组织因了的表达建立一种可控性的大鼠颈总动脉狭窄模型。方法：54只SD大鼠随机分为9组，用自制硅胶管套扎左颈总动脉中段，术后不同时相点用TS 420型多普勒血流仪测定血流量，灌注前用DIGITEXα数字血管减影操作系统测定血管内径，用Poiseiuue流体力学公式Tw=32ηQ／πD^3计算切应力。结果：颈总动脉狭窄85％后，平均血流量减少了65％，局部切应力发生了显著变化（P〈0．01），在7d内无明显改变。结论：硅胶管套扎大鼠颈总动脉中段的狭窄模型，是比较理想的在体检测血流壁切应力改变对血管内皮细胞形态和功能影响的方法。     

高血压与低切应力对大鼠颈总动脉血管重建的影响

目的研究高血压与低切应力对血管重建的影响及其机制,这对于阐明血管疾病的发病机理以及提供诊断、治疗的一些基本原理都将有重要的理论和实际意义。方法通过腹主动脉缩窄,结扎左颈总动脉的部分分支建立高血压、左颈总动脉低切应力以及高血压伴有低切应力大鼠动物模型。几何形态学方法观测左颈总动脉的壁厚及壁厚/内径比的变化;金属蛋白酶谱法分析MMP-2活性;免疫印迹法检测信号通路分子p-Akt分子以及Rho GDIα的表达变化。结果高血压和低切应力均可诱导颈总动脉MMP-2活性和壁厚及壁厚/内径比显著增加;当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导颈总动脉MMP-2活性和壁厚及壁厚/内径比进一步增加,从而促进血管重建。低切应力可诱导颈总动脉p-Akt的表达水平,且与低切应力大小相关,切应力低,p-Akt的表达水平高。当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导p-Akt的表达水平进一步增加。高血压和低切应力可诱导颈总动脉RhoGDIα表达增加;当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导颈总动脉Rho GDIα表达进一步增加。结论高血压与切应力协同作用对血管重建的影响最为显著,Akt和Rho GDIα信号通路参与了高血压与低切应力诱导的血管重建过程。     

血流切应力变化导致颈总动脉重建及其对血管平滑肌细胞凋亡和分化的影响

目的　探讨动脉血流切应力变化对动脉壁形态结构、零应力状态以及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)凋亡和去分化的影响。方法　结扎大鼠左侧颈总动脉的部分分支，使血液全部经由枕动脉流出，造成左颈总动脉(LCA)低血流和低切应力以及对侧右颈总动脉(RCA)高血流和高切应力状态，以假手术不结扎动脉的动物为正常对照。取LCA和RCA，光镜和透射电镜观察血管壁组织形态学变化；测量血管零应力状态下的张开角；TUNNEL法进行原位细胞凋亡检测；免疫印迹法检测VSMC表型分化标志分子hl-calponin的表达。结果　术后7d，低切应力LCA的内径减小了13%左右，壁厚内径比显著增加，张开角显著减小；内皮下层明显增厚，VSMC凋亡数量显著增加，VSMC表型分化标志分子hl-calponin的表达量显著降低。结论　血流切应力显著降低会在短期内引起血管重建，提示VSMC凋亡和去分化可能是低血流和低切应力导致血管重建的早期事件之一。     

高糖和不同浓度胰岛素对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨高糖和不同浓度胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响及可能机制.方法:组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉VSMCs,用高糖和不同浓度胰岛素诱导细胞增殖.实验设对照组、高糖组、高糖和不同浓度胰岛素组.采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]比色法测定VSMCs增殖;免疫细胞化学技术检测VSMCs增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)含量;RT-PCR技术检测VSMCs中PCNA mRNA的表达量;NO试剂盒检测培养基上清液中NO含量.结果:高糖能诱导VSMCs的增殖,而胰岛素则呈剂量依赖性地协同高糖诱导VSMCs增殖,最大作用效果出现在300 mU/L胰岛素培养的第5天;高糖可以使PCNA蛋白含量增加,而高糖和高浓度胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA蛋白含量显著增加;高糖可使PCNA mRNA表达量增高,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA mRNA表达量显著增高;高糖可使NO含量降低,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使NO含量显著降低.结论:胰岛素呈剂量依赖性地协同高糖促进VSMCs增殖,使VSMCs PCNA蛋白含量和PCNA mRNA表达量增高,并协同高糖降低NO的产生.     

L-NAME诱导妊娠高血压大鼠动脉重建的特征

目的探讨妊娠高血压大鼠动脉重建的特征。方法采用亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro-arginine methylester,L-NAME)诱导,构建妊娠高血压大鼠模型,以正常孕鼠为对照,用无创鼠尾血压测量仪测量血压以确认模型构建成功。测量血液黏度、左侧颈总动脉平均血流量,检测胸主动脉和颈总动脉的管壁厚度、管腔内径、张开角,计算并比较颈总动脉平均切应力的变化。Western blotting检测胸主动脉血管成分胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ,ColⅠ)、胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ,ColⅢ)表达,分析动脉血管重建程度。结果妊娠高血压模型大鼠血黏度增加,平均血流量降低;颈总动脉和胸主动脉壁厚内径比明显增大;颈总动脉张开角减小,胸主动脉张开角增大;颈总动脉平均切应力降低(28.52±3.08)%;ColⅠ表达下降,ColⅢ表达增加,ColⅠ、Ⅲ比例显著减小。结论妊娠高血压大鼠平均切应力下降,胸主动脉和颈总动脉发生血管重建。研究结果可以为妊娠高血压发病机制的深入研究提供基础实验数据支撑。     

活化激酶C受体1在切应力调控血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的 探讨活化激酶C受体1（receptor for actived C kinase 1, RACK1）在内皮细胞（endothelial cells, ECs）感受切应力刺激调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用及其机制。方法 应用平行平板流动腔系统,对联合培养的大鼠ECs和VSMCs施加1.5 Pa正常切应力（normal shear stress, NSS）和0.5 Pa低切应力（low shear stress,LowSS）,应用BrdU ELISA方法检测VSMCs增殖水平,对蛋白质组学研究发现的力学响应分子RACK1表达以及Akt磷酸化,应用Western blot技术进行检测。静态条件下,应用RNA干扰技术特异性抑制VSMCs的RACK1表达,检测其对细胞增殖和Akt磷酸化的作用。应用ECs与VSMCs隔开培养和联合培养模型,检测ECs对VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化水平的影响。结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,RACK1在LowSS组血管组织的表达水平明显升高。细胞实验结果显示,LowSS诱导了与ECs联合培养的VSMCs增殖,上调VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化。静态条件下,特异性抑制VSMCs的RACK1表达后,VSMCs的增殖水平和Akt磷酸化水平均显著下降。与ECs联合培养VSMCs,其RACK1表达和Akt磷酸化水平较隔开培养组均上调。结论 VSMCs的RACK1表达受细胞接触与切应力的影响,并可能通过PI3K/Akt信号通路参与LowSS诱导的VSMCs增殖的调控。探讨VSMCs增殖功能变化及其力学生物学机制对于认识动脉粥样硬化等疾病发病机理和疾病防治有重要意义。     

压力诱导血管平滑肌细胞整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的变化

目的 研究压力对大鼠颈总动脉血管平滑肌细胞整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的分布与表达的影响，探讨它们在血管平滑肌细胞的机械应力信号转导中的作用。方法 不同压力(160mmHg和80mmHg)灌流大鼠颈总动脉30min，免疫组织化学和免疫电镜观察整合素β3、桩蛋白和纽蛋白在血管平滑肌细胞上的表达和分布变化。结果 高压和常压灌流对大鼠颈总动脉平滑肌细胞的整合素β3、桩蛋白和纽蛋白的表达无明显影响，但高压使整合素β3、桩蛋白和纽蛋白在平滑肌细胞膜上的分布发生改变，向离管腔面的平滑肌细胞膜聚集。结论 高压诱导了整合素β3、桩蛋白和纽蛋白向离管腔面的平滑肌细胞膜聚集。提示整合素β3、桩蛋白和纽蛋白可能在血管平滑肌细胞的机械应力信号转导中发挥作用。     

FOXO1参与高血压条件下异常张应变诱导的血管平滑肌细胞增殖

目的 探讨高血压条件下异常升高的周期性张应变刺激对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖的影响,以及Forkhead转录因子1（FOXO1）在其中可能的作用。方法 构建腹主动脉缩窄高血压大鼠模型,并以假手术组为对照,应用FX-4000T体外周期性张应变加载系统,分别对VSMCs施加5%的生理性张应变和15%的高血压病理性张应变。Western blot检测VSMCs的FOXO1及p-FOXO1表达水平,BrdU法检测VSMCs 增殖活性。RNA干扰技术抑制VSMCs的FOXO1表达,检测FOXO1、p-FOXO1表达以及VSMCs增殖活性变化。结果 腹主动脉缩窄术后 2和4周,大鼠血压较假手术大鼠明显增高。与假手术大鼠相比,高血压大鼠血管壁细胞增殖活性明显增高,同时 FOXO1及 p-FOXO1表达水平也显著性升高。细胞实验表明,与5%张应变组相比,15%张应变加载显著上调VSMCs的FOXO1、p-FOXO1表达水平,以及VSMCs增殖活性。静态条件下RNA干扰抑制VSMCs的FOXO1及p-FOXO1表达,VSMCs的增殖活性明显降低。结论 高血压病理条件下,异常增高的周期性张应变可能通过促进 FOXO1表达和磷酸化诱导VSMCs增殖。以动物模型观察现象,在细胞分子水平探讨机制,旨在明确FOXO1在高血压血管重建中的作用及其力学生物学机制,为阐明高血压血管重建的发病机理和药物治疗靶标的研究提供新的实验依据。     

Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程

目的： 探讨Smad通路是否参与细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的过程及其可能机制。方法：将人脐动脉平滑肌细胞（hUASMCs）分为对照组、血小板源性生长因子（PDGF）组、ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。用MTT法测hUASMCs的增殖活性(A值)，用免疫组化法测hUASMCs内细胞核增殖抗原（PCNA）、磷酸化ERK和磷酸化Smad蛋白的表达，用RT-PCR法测hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达。结果：PDGF组hUASMCs的增殖活性(A值)及hUASMCs内的PCNA、磷酸化ERK和磷酸化Smad2/3蛋白的表达都明显高于其它各组(P<0.01)；各组hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达没有差异。结论： Smad通路可在蛋白水平参与ERK通路诱导VSMCs的增殖过程。     

串珠素对大鼠平滑肌细胞增殖的影响及其机制的研究

目的 观察串珠素对于大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells。VSMCs）增殖反应的影响以及细胞信号转导机制。方法以^3H-TdR掺人法测定VSMCs增殖。Westem blot方法检测FAK表达。结果 Perlecan加强碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）引起的VSMCs增殖反应，并诱导粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）表达上调。Perlecan抗体消除Perlecan促进bFGF致VSMCs增殖反应，并抑制FAK表达。结论 串珠素增强bFGF致大鼠平滑肌细胞的增殖反应，其机制涉及FAK表达上调。     

动脉粥样硬化大鼠血管损伤后局部组织学结构的变化

目的建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型，了解血管成形术后再狭窄的发生规律及病理机制。方法在大鼠动脉粥样硬化病变的基础上，使用2F球囊导管损伤大鼠左侧颈总动脉，观察术后不同时期内膜、中膜增生的动态改变；对血管壁增殖的细胞进行鉴定；观察血管壁平滑肌细胞表型标志物SMα—actin表达的变化。结果损伤后7天薪生内膜开始形成，至3月时内膜增厚达最大，管腔明显狭窄，损伤动脉壁可见细胞大量增殖，大部分为平滑肌细胞。损伤早期血管壁表达SMα—actin减少，至损伤后期逐渐恢复至原有水平。结论应用球囊导管可以成功建立大鼠血管损伤动物模型，损伤后新生内膜增生导致管腔狭窄，平滑肌细胞的表型改变、迁移及增殖是内膜过度增生的病理基础。     

张应变调控的核骨架蛋白在高血压血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的:高张应变诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)异常增殖在高血压血管重建发生发展中起重要作用。本研究探讨细胞核骨架(nuclear envelope,NE)在其中的作用及其机制。方法:应用腹主动脉缩窄构建高血压大鼠动物模型;应用FX4000张应变加载系统对体外培养大鼠胸主动脉VSMCs分别施加5%(正常生理状态)和15%(模拟高血压状态)幅度的周期性张应变;Western blot检测NE蛋白emerin和lamin A蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀、芯片(CHIP-onchip)结合MOTIF生物信息学分析检测与emerin和lamin A结合的DNA序列及其特性;protein/DNA array检测抑制emerin或lamin A表达后转录因子活性变化。结果:高血压大鼠颈总动脉emerin和lamin A表达水平明显降低,中膜VSMCs增殖明显增加;体外加载15%周期性张应变模拟高血压病理条件下VSMCs受到的张应变力学刺激,VSMCs的emerin和lamin A表达明显降低,细胞增殖明显增加,这一作用可被emerin或lamin A的高表达载体转染所部分逆转。emerin和lamin A能够分别与包含多种转录因子启动子结合位点的DNA片段结合,进而调控多种与VSMCs增殖相关的转录因子活性。结论:NE蛋白emerin和lamin A能够响应力学刺激,并通过调控与特异性转录因子启动子区域的结合调控转录因子活性,参与VSMCs增殖功能调控和高血压血管重建。     

超声波辅助转染PDGF-B mRNA的反义寡肽核酸抑制兔动脉再狭窄

目的：探讨反义寡肽核酸在体内对血管平滑肌细胞增殖和再狭窄的影响。方法：建立兔髂动脉再狭窄模型，用合成的反义寡PNA作为药物以超声波辅助转导局部血管壁细胞，分别用原位分子杂交和LSAB免疫组织化学法检测PDGF-B mRNA和PCNA表达；用形态测量法检测血管内膜厚度和面积。结果： PNA显著抑制损伤后1周内膜VSMCs表达PCNA和PDGF-B mRNA，与对照组相比抑制率分别为84.19%和63.95%；显著减少血管内膜厚度和面积。 结论：反义寡PNA可阻止兔VSMCs增殖及内膜增生。     

自发性高血压大鼠颈总动脉的平均壁面切应力和周向应力

目的确定自发性高血压大鼠(SHR)颈总动脉的平均壁面切应力(WSS)和周向应力(CS),并与同龄正常血压大鼠(WKY)相对比,观察SHR和WKY大鼠颈总动脉平均WSS和CS的特征。方法选取12周龄SHR作为动物模型,同龄WKY为对照组;通过在体测定颈总动脉的平均血流量与平均血压,离体测量颈总动脉的无载荷状态形态学数据,以及在体轴向伸长比条件下颈总动脉段的压力(p)-容积(V)关系,确定颈总动脉平均WSS和CS;同时比较SHR和WKY颈总动脉的平均血压和血流量、无载荷和载荷状态几何尺寸以及平均WSS和CS的特征。结果与正常血压的WKY组相比,SHR组颈总动脉血压明显增高、流量明显降低;无载荷和载荷状态下SHR组动脉的内外半径均增大,载荷状态下SHR组动脉壁厚减小;SHR颈总动脉平均WSS明显降低,而CS明显增高。结论高血压和低流量引起了SHR颈总动脉重建;低WSS和高CS是SHR颈总动脉血液动力学参数的重要特征;WSS和CS的协同作用可能是反映动脉重建的敏感指标之一。