缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的：发现并克隆缺血再灌可诱导基因,方法：应用mRNA差异显示技术,在猪的心肌组织,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段,随后筛选狸心脏cDNA文库,经克隆,测序,杂交后,分析克隆基因的基本特性,结果：发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段,通过筛选cDNA文库获得一个编码608个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因,蛋白质氨基酸均无同源性,Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高,并且在正常猪的心,肝,肺,肾,脾,肠,脑和骨骼肌组织均可检测到其表达,Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性,结论：克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

两个缺血再灌可诱导新基因的表达与克隆

目的 :发现和克隆短暂缺血再灌注心肌组织内mRNA表达发生改变的基因。方法 :反复短暂结扎猪左冠状动脉前降支引起缺血再灌 ,从受累心肌组织中提取RNA并用于mRNA差异显示。经克隆和测序其cDNA序列后 ,用Northern杂交进一步证实其表达。结果 :克隆并确证两个cDNA(即W12和W2 8)为真正差异表达。它们在缺血再灌心肌中的表达明显高于非缺血的心肌 ,W12 ,W2 8表达水平分别为非缺血心肌的 2 0倍 (P <0 0 5 )和 1 9倍 (P <0 .0 5 )。另外 ,在猪心脏、肝、肺、肾、脾、肠、脑、骨骼肌等组织器官均可检测到它们的mRNA。DNA序列分析显示 ,该两个cDNA与已知基因均无同源性 ,表明它们代表新的基因。结论 :发现和克隆到两个缺血再灌可诱导的新基因     

两个缺血再灌可诱导新基因的表达与克隆

目的：发现和克隆短暂缺血再灌注心肌组织内mRNA表达发生改变的基因。方法：反复短暂结扎猪左冠状动脉前降支引起缺血再灌，从受累心肌组织中提取RNA并用于mRNA差异显示。经克隆和测序其cDNA序列后，用Northern杂交进一步证实其表达。结果：克隆并确证两个cDNA（即W12和W28）为真正差异表达。它们在缺血再灌心肌中的表达明显高于非缺血的心肌，W12，W28表达水平分别为非缺血心肌的2．0倍（P＜0．05）和1．9倍（P＜0．05）。另外，在猪心脏、肝、肺、肾、脾、肠、脑、骨骼肌等组织器官均可检测到它们的mRNA。DNA序列分析显示，该两个cDNA与已知基因均无同源性，表明它们代表新的基因。结论：发现和克隆到两个缺血再灌可诱导的新基因。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的：采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库。方法：以食管癌组织为测试子（tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子（driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管消减cDNA文库。结果：用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R 的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论：构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

猪脑硫氧还蛋白还原酶基因片断的序列分析

目的 :在猪脑细胞中分离并克隆硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因片段 ,以人脑TR基因片段为参照比较分析 ,探讨选择猪作为研究TR基因功能实验动物模型的可能性。方法 :(1)进行逆转录 -聚合酶链式反应 (RT PCR) ,获得TR基因cDNA ;(2 )插入pGEM T载体 ,转化至大肠杆菌 ;(3)筛选并鉴定阳性克隆 ,纯化重组子并测序 ;(4 )将测序结果与人脑TR基因序列比较。结果 :(1)获得了一个 6 0 6bp大小的猪脑细胞TR基因片段 ,含有 196个氨基酸。(2 )猪脑TR基因片段序列与基因库中的人脑TR基因序列有 88%同源性 ;(3)猪脑TR氨基酸序列中有 18个氨基酸与人脑TR不同 ,同源性为 90 %。结论 :猪与人TR基因的同源性较大 ,选择猪作为研究TR功能的实验动物有一定的可能性。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

mRNA差异显示技术在紫杉醇诱导的表达基因克隆中的应用

作者应用mRNA差异显示、DNA序列分析和Northern杂交技术，对紫杉醇处理人乳癌细胞诱导的表达基困进行cDNA克隆研究，12个克隆有明确的mRNA水平表达改变，其中6个cDNA克隆核旮酸序列与已知的cDNA序列有较高的同源性，其余6个尚无同源性基因。克隆C3P3与人腺苷基蛋氨酸合成酶基因序列同源性达99％，紫杉醇诱导该酶基因转录活动和基因产物活性增高。提示mRNA差异显示技术在筛选mRNA水平表达差异的基因cDNA克隆研究中是可行的和有效的。     

人巨核白血病细胞诱导分化后差异表达基因的mRNA差别显示和克隆

目的：克隆巨核白血病细胞诱导分化后表达变化的mRNA，从中寻找对诱导分化起关键作用的基因，最终揭示巨核白血病细胞诱导分化的分子机制。方法：人巨核白血病细胞HIMeg经13-顺式维甲酸处理4 d后，收集细胞总RNA，进行mRNA差别显示、cDNA片段克隆和序列分析。结果：获得5个差示cDNA片段，经RNA点杂交分析后发现其中3个为假阳性，1个因没有杂交信号而无法确定，只有1个cDNA片段得到证实，其对应的mRNA在诱导分化后表达下降。该cDNA片段的核苷酸序列已在GenBank中登录，登录号为AF026526。结论：克隆到一个未知基因的cDNA片段，其全长cDNA序列、基因结构及生物功能有待进一步研究。     

梅花鹿两个管家基因部分 cDNA序列的克隆

目的 :开发吉林双阳梅花鹿的基因资源 ,在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 :从鹿脾脏细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,构建 c DNA质粒文库 ,从中克隆 2个管家基因并进行序列分析。结果 :成功克隆的管家基因的一个核酸序列及其对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠蛋白酶体 α3型亚单位 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源 ;另一个管家基因的序列及对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠转录激活因子 - 4部分 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源。结论 :新发现的双阳梅花鹿蛋白酶体α3型亚单位部分 c DNA序列和转录激活因子 - 4部分c DNA序列 ,已在 Genbank中登录 ( BG67371 3,BG67371 4 )。     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

小鼠β趋化因子受体CCR5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂ ｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂ ｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｍ方法检测分析该ＡＤＬＤ，Ｎｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

大鼠MIP3基因的电子克隆和特性分析

210 .seq是一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签 (expressedsequencetag ,EST) ,用GENSCAN预测、Blast(Basiclocalalignmentsearchtool)比对、序列拼接、多序列比对等生物信息学方法克隆了该EST代表的大鼠MIP3基因的cDNA序列。大鼠MIP3基因的开放阅读框为 1332bp ,起始密码子前同一相位存在一个终止密码子 ,起始密码子邻近的序列符合Kozak规则 ;推测编码 4 4 3个氨基酸 ,与小鼠和人的MIP3基因or tholog的同源性很高 ,但是与数据库中其它蛋白质的同源性不高。TMpred分析显示该多肽有一个跨膜区域 ,氨基端位于膜内。Motifscan分析仅发现一个脯氨酸富集区域。以上结果显示MIP3基因是一个功能未知的新基因     

树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

人泛素结合酶cDNA的分离与克隆

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究其组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物,筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计控针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫