HBV-HCV-HIV三联荧光PCR检测的内标浓度选择研究

目的 选择一个在乙型肝炎病毒-丙型肝炎病毒-人类免疫缺陷病毒（HBV—HCV—HIV）三联荧光PCR检测试验中既可有效监控假阴性结果出现,又对阳性结果影响最小的内标浓度。方法应用不同浓度的内标参入酶链聚合反应（PCR）反应,确定最佳内标参人量;并在适量内标浓度下,检测低浓度标本的阳性检出率。结果由内标浓度5拷贝／PCR、10拷贝／PCR、20拷贝／PCR、50拷贝／PCR、100拷／PCR5个浓度中,优选出最适的内标浓度为20拷贝／PCR,此条件下,阴性标本的内标检出率为100％,检测灵敏度标本的阳性检出率与无内标样本差异无统计学意义。结论合适浓度的内标参与荧光PCR检测能有效地解决了每个标本的质控问题,指示反应体系（试剂耗材）与检测体系（仪器）的有效性。     

核酸血液筛查试剂内标质控效果研究

目的竞争性内标对核酸检测灵敏度的影响程度及方式,探寻采用适度的内标质控浓度,用于有效控制核酸检测过程。方法使用竞争性混合内标试剂对不同浓度的HBV、HCV、HIV阳性标本检测,HBV内标浓度<103IU/ml,HCVt HIV内标浓度为(200—300)IU/ml。结果HBV内标浓度<5IU/ml检出率<95%,浓度>10IU/ml后检出率≥95%,HCV、HIV内标浓度<100IU/ml检出率<95%,≥100IU/ml检出率≥95%。结论内标(内参照)把质量控制从每批阳性质控提高到每管阳性质控的水平,能有效减少假阴性检测结果,竞争性内标结构和待检物几乎完全相同,更能真实反应情况。     

实时荧光PCR技术在手足口病检查中的应用

目的采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)法检测手足口病患儿病原体。方法收集433例疑似手足口病患儿的粪便标本进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型(EV-71)和柯萨奇病毒16型(CA-16)鉴别与分析。结果实时荧光PCR法检测433例患儿肛拭子标本使用通用型试剂盒检出366例阳性,其中66例为EV-71感染,151例为CA-16感染。结论 EV-71和CA-16肠道病毒是手足口病的主要病原体,该地区2011年以CA-16感染为主,实时荧光PCR技术对手足口病的病原诊断具有重要价值。     

内标荧光定量PCR技术在乙型肝炎病毒定量中的应用

目的　建立内标荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒 (HBV)DNA ,以避免PCR扩增过程中可能出现的假阴性或部分抑制。方法　在TaqMan荧光探针杂交PCR技术检测HBV载量的基础上 ,结合内标参照的方法指示PCR的扩增效率。结果本检测方法具有很好的特异性、重复性 ,检测敏感度达到 1× 10 3 copies/ml。经过对 382例乙肝患者标本测定证实 ,标志物为HBsAg( )、HBeAg( )、抗HBc( )的血清检出率为 10 0 % ,标志物为HBsAg( )、抗HBe( )、抗HBc( )的血清检出率为 72 .0 % ,与Roche试剂比较 ,两者的相关系数为 0 .987。结论　本法快速、简便、特异性好、能指示病毒感染程度。     

定量PCR的研究进展

定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的基因定量技术，克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。本文就定量PCR技术中的竞争性PCR和荧光定量PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测副溶血弧菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测副溶血弧菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对副溶血弧菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19cfu/mL,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

荧光定量PCR法检测肿瘤细胞株转录因子表达水平

目的 建立荧光定量聚合酶链反应(fluorogenic quantitative PCR)检测方法，以便快速、准确地定量检测细胞株转录因子表达强度。方法 根据基因序列，设计合成引物．采用一步法提取细胞株总RNA，逆转录获取cDNA，通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T—box expression in Tceils(T—bet)，GATA3的表达水平进行检测。结果 细胞株NK92、QBC939、K562、HO-8910、A549、HeLa转录因子T—bet的表达强度分别为0．90、1．25、0．96、0．92、1．1l和1．17，GATA3的表达强度分别为1．23、1．49、1．30、0．97、1．05和1．34。结论 建立丁肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法，较常规PCR方法更为简便、快速、准确，有很好的应用前景。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

CMV-DNA荧光定量PCR检测室内质控物的制备及初步应用

目的制备巨细胞病毒DNA(CMV-DNA)荧光定量PCR检测的室内质控物,并对其临床应用进行初步评价。方法收集一批CMV-DNA阳性尿液标本混合后作为室内质控物,前20次检测采用"即刻法"判断结果是否在质控范围内,20次后采用Levey-Jennings质控图,确定其靶值、标准差和变异系数,对室内质控结果进行判断。结果 107次试验中,前20次根据"即刻法",室内质控结果在控;20次后采用Levey-Jennings质控图,结果在控;60次检测结果的均值为5.41,标准差为0.33,变异系数为6.15%。结论利用混合尿液标本制备CMV-DNA室内质控物,制备方便,测定结果稳定,可以用作本实验室检测CMV-DNA的室内质控物。     

实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测患儿手足口病病原体,为防治手足口病提供依据。方法收集手足口病疑似患儿189例(按年龄分为<3岁组113例、3～5岁组76例)及39例手足口病密切接触儿童的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR检测标本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),并与酶联免疫吸附试验(ELISA)结果进行比对。结果 189例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检测EV阳性141例,阳性率为74.6%,其中<3岁阳性91例、3～5岁阳性50例,3～5岁组EV检出率明显低于<3岁组(P<0.05);EV71阳性135例,CoxA16阳性65例;咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161),疮疹液标本阳性率为82.1%(23/28);ELISA检测EV阳性76例(40.2%);39例手足口病密切接触者FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39),ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。结论 FQ-PCR是一种特异性强、灵敏度高、检测较快速、效率高的方法,对检测手足口病病原体及进行相关流行病调研有重要价值。     

Cloning and development of synthetic internal amplification control for Bacillus anthracis real-time polymerase chain reaction assays

An internal amplification control (IAC) was developed for Bacillus anthracis rpoB gene detection using TaqMan assay. Synthetic IAC oligonucleotides were subcloned using vector pDG1730 for ectopic integration into host Bacillus subtilis strain 1A772 genome. Differentially labeled target and IAC probes were used in real-time polymerase chain reaction (PCR) assays. There was no nonspecific cross-detection in single-well reactions. Limit of detection for both target and IAC DNA was 5 fg corresponding to a single gene copy. The IAC, in conjunction with target system, should decrease the rate of false-positive and false-negative results in real-time PCR assays.     

实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因表达

目的建立检测肺癌肿瘤抑制因子1（TSLC1）基因mRNA表达的实时荧光聚合酶链反应（PCR）方法。方法设计特异性引物和TaqMan探针,以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因作为对照,建立检测TSLC1基因表达的实时荧光PCR方法,并采用细胞株和宫颈组织样本进行验证。结果该方法检测TSLC1基因mRNA的检测下限为每反应10个细胞或2拷贝cDNA,总不精密度为3.1%。TSLC1基因mRNA在子宫肌瘤、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）与宫颈癌患者宫颈组织中的表达率分别为100%、75%、55%和24%。宫颈癌细胞株中未检出TSLC1基因mRNA表达。所有样本中均有GAPDH基因mRNA表达。结论该实时荧光PCR方法能够有效检测TSLC1基因mRNA表达,是进一步研究TSLC1基因在宫颈癌发生中的作用及宫颈癌早期诊断的重要工具。     

A TaqMan probe-based multiplex real-time PCR method for the specific detection of wild type lumpy skin disease virus with beta-actin as internal amplification control

Lumpy skin disease (LSD) is a transboundary disease of economic importance affecting cattle and buffaloes. In South-Eastern Europe, immunization of cattle with homologous live attenuated vaccines for LSD control has prevented outbreaks since 2017, but has been associated with adverse reactions resembling disease symptoms. Thus, a diagnostic method suitable for disease surveillance in farms during vaccination campaigns with Neethling (Onderstepoort) and SIS type (Lumpyvax) live attenuated LSDV vaccines in Europe should be able to detect the wild type (WT) LSDV in animals with adverse reactions to the vaccines and samples with potentially high titers of the vaccine LSDV. To this end, a real-time PCR method targeting the EEV gene of LSDV was developed for the specific detection of WT strains, along with the use of beta-actin gene as an internal amplification control (IAC). Amplification efficiency of the WT virus target was 99.0% and 98.6%, in the presence and in the absence of high loads of vaccine LSDV, respectively. In the presence of 10^5.6 vaccine LSDV DNA copies, the limit of detection for WT LSDV was 12.6 DNA copies per reaction. The inter-assay CV was 0.04% for WT LSDV and 0.13% for beta-actin. The method can confirm diagnosis in suspect cases irrespective of the presence of the vaccine LSDV DNA by overcoming the masking effect of the WT LSDV. The simultaneous amplification of the beta-actin gene further assures the quality of diagnostic testing. The new method is a surveillance tool, complementing the DIVA real-time PCR during vaccination campaigns and can provide rapid insight on the targeted EEV gene in countries with novel and recombinant LSDV strains.     

应用实时荧光PCR分析apoE3、4等位基因

目的 建立实时荧光PCR进行apoE单核苷酸多态性(SNP)分析法,快速检测人栽脂蛋白E(apoE)等位基因.方法 以人apoE基因中的Cys112Arg为研究对象,用荧光染料SYBR Green Ⅰ标记PCR产物,通过熔解曲线分析结果,并进行SNP分型.用高保真DNA聚合酶提高SNP测定的特异性;通过DNA测序验证荧光定量PCR对apoE基因Cys112Arg分型结果的准确性.结果 每个样品设立2个检测管,利用下游引物P2和SNP检测引物P33、P44进行定量PCR反应,30份样品各自获得2种等位基因扩增产物的熔解曲线,通过熔解曲线的Tm值判读,在30份样本中,apoE基因型3/3、3/4分别有27例和3例,与PCR-RFLP及DNA测序结果一致.结论 建立的apoE等位基因分型法操作简便,结果准确,适合人外周血apoE等位基因的定性检测.     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。