转染LCRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析

背景与目的:LCRG1基因是我室利用mRNA差异显示技术克隆的一个喉癌相关抑癌基因。先前的研究显示将LCRG1转染喉癌细胞系Hep-2,发现其具有抑制细胞增殖、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤能力的作用。本研究旨在利用比较蛋白质组学的方法筛选LCRG1抑瘤作用相关的蛋白质。方法:抽提稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1( )的细胞总蛋白,采用双向凝胶电泳技术分别分离其总蛋白。考马斯亮蓝染色显色,PDQuest图像分析系统分析获取的2-D胶图像,从胶中选取差异表达的蛋白质点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析,最后Mascot软件搜索数据库初步鉴定蛋白质。结果:获得了重复性和分辨率较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1( )细胞系的双向凝胶电泳图谱,总蛋白质点数分别为1075±43和1027±23,平均匹配率为91%。图像分析差异蛋白质点,质谱鉴定了20个差异表达的蛋白质点,其中MALDI-TOF-MS鉴定了16个,ESI-Q-TOFMS/MS鉴定了4个。对这些初步鉴定的差异蛋白质进行功能分析,发现一些与细胞代谢、转录调控相关的蛋白质。结论:建立了稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1( )细胞系的双向凝胶电泳图谱,应用质谱技术识别并鉴定出一些与LCRG1抑瘤作用相关的差异表达蛋白质,为进一步研究LCRG1作用的分子机制提供新的线索。     

喉部相关基因LCRG1的鉴定和功能初步研究

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外显子,基因组DNA跨越60多kb, 定位于染色体17q12-21.1上,为喉癌等许多肿瘤的高频杂合性质丢失区域。MTN膜杂交显示该基因在多组织中表达。差异RT－PCR显示有40A％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT－PCR显示有54．5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。通过GFP荧光定位的方法,发现该基因编码的蛋白定位在核内。把该基因命名为喉癌相关基因（LaryngeaI Carcinonm Related Gene 1,LCRG1)。将LCRG1cDNA导入到此基因不表达的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制;抑制Hep-2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。上述结果提示：喉癌相关基因LCRG1与喉癌的发生发展密切相关。     

肿瘤相关蛋白的亚细胞定位

随着分子生物学等学科领域水平的不断发展，发现肿瘤相关蛋白的种类和数量不断增多，它们在肿瘤细胞中的静态分布和动态移动过程，定性和定量，肿瘤细胞周期不同时期的变化，需要通过亚细胞定位技术进行观察，下面将不同定位技术进行分述。     

白血病相关蛋白16亚细胞定位的研究

目的:研究白血病相关蛋白LRP16基因编码蛋白在真核细胞内的亚定位分布.方法:将LRP16全长基因序列(长型/L型)与LRP16天然缺失体编码序列(短型/S型)融合到绿色荧光蛋白pEGFP真核表达载体的N端,转染鼠成纤维NIH3T3、人乳腺癌MCF-7细胞株,观察绿色荧光的分布;采用细胞免疫荧光染色(CIF)方法和激光共聚焦显微镜进一步鉴定内源性LRP16蛋白在上皮起源性肿瘤乳腺癌MCF-7、宫颈癌Hela,人胚肾293T细胞株的亚细胞分布.结果:绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFP L型在NIH3T3细胞系中以细胞浆型分布为主,在MCF-7中以细胞核型分布为主,绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFP S型在真核细胞内呈核浆均匀分布;CIF染色结果表明内源性LRP16(长型/L型)蛋白在MCF-7、Hela和293T细胞中分别亚定位于细胞核.结论:LRP16是在上皮起源性肿瘤细胞中作为核因子参与其进展,野生型LRP16(长型/ L型)前82个氨基酸在决定LRP16亚定位方面发挥关键作用.     

转染LGRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析

背景与目的LCRG1基因是我室利用mRNA差异显示技术克隆的一个喉癌相关抑癌基因.先前的研究显示将LCRG1转染喉癌细胞系Hep-2,发现其具有抑制细胞增殖、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤能力的作用.本研究旨在利用比较蛋白质组学的方法筛选LCRG1抑瘤作用相关的蛋白质.方法抽提稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)的细胞总蛋白,采用双向凝胶电泳技术分别分离其总蛋白.考马斯亮蓝染色显色,PDQuest图像分析系统分析获取的2-D胶图像,从胶中选取差异表达的蛋白质点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析,最后Mascot软件搜索数据库初步鉴定蛋白质.结果获得了重复性和分辨率较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,总蛋白质点数分别为1 075±43和1027±23,平均匹配率为91%.图像分析差异蛋白质点,质谱鉴定了20个差异表达的蛋白质点,其中MALDI-TOF-MS鉴定了16个,ESI-Q-TOF MS/MS鉴定了4个.对这些初步鉴定的差异蛋白质进行功能分析,发现一些与细胞代谢、转录调控相关的蛋白质.结论建立了稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,应用质谱技术识别并鉴定出一些与LCRG1抑瘤作用相关的差异表达蛋白质,为进一步研究LCRG1作用的分子机制提供新的线索.     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

92. 喉癌相关基因LCRG1的鉴定和功能初步研究

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的在喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外显子,基因组DNA跨越60多kb,定位于染色体17q12～21.1上,为喉癌等许多肿瘤的高频杂合性丢失区域。MTN膜杂交显示该基因在多组织中表达。差异RT-PCR显示有40％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT-PCR显示有54.5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。通过GFP荧光定位的方法,发现该基因编码的蛋白定位在核内。把该基因命名为喉癌相关基因（LaryngeaI Carcinoma Related Gene 1,LCRG1）。将LCRG1 cDNA导入到此基因不表达的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制;抑制Hep-2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。上述结果提示：喉癌相关基因LCRG1与喉癌的发生发展密切相关。     

喉癌相关抗原的表达及特性研究

目的 探讨喉癌相关抗原的生物学特性及在喉癌组织中的表达。方法 应用抗人喉鳞状细胞癌单克隆抗体Ｌｃ９、Ｌｃ１１、Ｌｃ１２三株混合,以免疫组化ＡＢＣ法观察与喉癌组织、喉癌前病变及喉正常粘膜的结合情况。将手术切除的３例人喉癌组织研磨匀浆后,混合,高速离心得到喉癌粗提抗原,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－７５凝胶过滤层析技术得到纯化的喉癌抗原。抗原经胰蛋白酶消化,高碘酸钠、甲醇及加热处理,进行间接ＥＬＩＳＡ检测,     

多药耐药相关蛋白的生物学特性与作用机制的研究进展

多药耐药性相关蛋白（MRP1）是ATP结合的盒式（ABC）膜转运蛋白家族成员,基因敲除实验表明MRP1存在与否不影响小鼠正常的生存和各项生理指标,生理条件下,它可能作为耗能泵游离的谷胱甘肽和某种尚不了解的内源性代谢物一起泵出细胞外,维持细胞外的还原环境。MRP1通过介导细胞内药物排出,改变药物细胞内分布引起肿瘤耐药。     

p27kip1亚细胞定位与肿瘤

p27kip1是一种广谱的细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)抑制剂,主要通过抑制CDK的活性,来阻断细胞周期中G1/S期的转换,从而实现对细胞周期的负调控.p27 kip1基因除了作为抑癌基因还有致瘤的潜能.这种双向性又在其亚细胞定位中体现,p27 kip1多个位点的磷酸化参与p27 kip1亚细胞定位的调控.这些研究可能对肿瘤的预后提示和治疗方面具有重要意义.本文就p27kip1亚细胞定位在肿瘤研究中的作用、磷酸化对p27kip1亚细胞定位的影响及p27kip1的研究对肿瘤治疗及预后方面的影响进行综述.     

LCRG1 SUPPRESSES TUMOR GROWTH IN VIVO BY LIPOSOME-MEDIATED GENE TRANSFER

Laryngeal Carcinoma is one of the common cancers harming to the health of human. Like other carcinomas, laryngeal carcinogenesis is a multistage process involving changes of multiple genes-the activation of oncogenes and the repression of tumor suppressors. Many data have showed that the expression of oncogenes such as Ras, C-myc, EGFR, Cyclin D1 are increased[1-4] and the tumor suppressor genes such as p53, Rb are mutated[1] in laryngeal carcinomas. However, till now its molecular mechani…     

LCRG1 suppresses tumor growth in vivo by liposome-mediated gene transfer

Objective: To investigate whether LCRG1 (Laryngeal Carcinoma Related Gene 1) has tumor suppressor function. Methods: The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/LCRG1 was successfully constructed. The biological effects of LCRG1 on Hep-2 cell line were studied by cell transfection, cell growth observation colony formation analysis and tumorigenicity experiments. Results: The LCRG1 gene potently inhibited tumorgenesis in vitro and in vivo, as showed by dramatic growth arrest observed in cell growth analysis and suppression of anchorage-independent growth and tumorigenicity in nude mice. Conclusion: Our results suggested that LCRG1 may be a candidate of tumor suppressor gene. Foundation item: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 39900052) and a grant from the Ministry of Health of PR China (No. 98-1-118). Biography: Li You-jun(1972–), doctor of medicine, assistant professor, Xiangya Medical School, Central South University, majors in pathology and pathophysiology.     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

FHIT基因及错配修复基因MLH1在结直肠癌中的表达研究

目的　探讨FHIT、MLH 1基因在结直肠癌组织中的表达及其意义。方法　采用免疫组化S P法检测 84例结直肠癌组织中FHIT、MLH 1基因表达。结果　FHIT、MLH 1基因在 84例结直肠癌中表达阳性率分别为 48.81%和 92 .86%。FHIT基因水平低或不表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型无关 (P >0 .0 5 ) ,而与肿瘤浸润深度、分化程度、Dukes分期和淋巴结转移有关 (P <0 .0 5 ) ;结直肠癌组织中FHIT基因表达与MLH 1基因表达无显著相关性 (P >0 .0 5 )。结论　FHIT基因参与了结直肠癌的演化和进展 ,是结直肠癌的 1个候选抑癌基因 ;结直肠癌组织中FHIT、MLH 1基因表达的关系还有待深入研究     

外源性Egr—1基因表达对食管癌细胞株Eca109细胞生长的影响

目的：检测Egr-1蛋白在食管癌细胞株Eca109中的表达。方法：采用免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在Eca109细胞中的表达,用脂质体基因转染法将真核表达载体PCMV－Egr-1质粒导入Eca109细胞,经Western blot和免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在转染的Eca109细胞中呈高表达。结果Eca109细胞的Egr-1蛋白表达阴性,当导入外源性Egr-1基因后,Egr-1捕达阳性,表达Egr-1蛋白的Eca109的细胞形态上发生明显的的变化,表现为细胞变偏,呈散在生长,结论Egr-1蛋白的表达在一定程度上能抑制Eca109细胞生长。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和基质金属蛋白酶-2在喉癌中的表达

目的　了解细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (EMMPRIN )和基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )在喉癌的表达情况 ,探讨两者表达的关系以及与喉癌浸润和转移的关系。方法　采用免疫组织化学S P法对 47例喉癌和 2 2例正常喉组织中的EMMPRIN和MMP 2的表达情况进行检测。结果　EMMPRIN和MMP 2在喉癌的阳性表达率 (分别为 87.2 %和 91.5 % )明显高于正常喉组织分别为 ( 9.1%和 18.2 % ) ,EMMPRIN和MMP 2的强阳性表达与喉癌的病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关 ;EMM PRIN和MMP 2的表达一致率为 91.5 % ,Kappa值为 0 .614 ,两者表达具有明显的相关性。 结论　EMMPRIN和MMP 2在喉癌有阳性表达 ,表达与喉癌的临床分期和淋巴结转移有关 ,EMMPRIN与MMP 2的产生有密切的关系     

VEGF与MMP-9在喉癌组织中的表达及其与血管生成的关系

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)与基质金属蛋白酶 -9(MMP -9)在喉癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法　采用免疫组织化学方法 ,检测 42例喉癌组织中VEGF与MMP -9表达及肿瘤微血管计数 (MVC)。结果　VEGF阳性表达者MVC值 (2 3 .82± 3 .71)显著大于阴性表达者 (19.5 3± 5 .43 ) ,MMP -9阳性表达者MVC值 (2 4.16± 4.0 6)亦显著大于阴性表达者 (2 0 .93± 4.3 2 ) ,VEGF、MMP -9表达与喉癌分化程度、临床分期无关。结论　VEGF与MMP -9在喉癌肿瘤血管生成过程中具有重要作用     

鼻咽癌中IGF-1R、p-ERK、c-fos和Ki-67蛋白的表达及意义

目的研究胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）蛋白与细胞增殖相关信号分子p-ERK、c-fos、Ki-67蛋白在鼻咽癌及鼻咽黏膜上皮细胞中的表达及意义。方法 SP法检测30例鼻咽癌、25例鼻咽黏膜上皮细胞中IGF-1R、p-ERK、c-fos、Ki-67蛋白的表达。结果 IGF-1R、p-ERK、c-fos和Ki-67蛋白在鼻咽癌细胞中阳性表达率分别为93.33%（28/30）、93.33%（28/30）、83.33%（25/30）、86.67%（26/30）,在鼻咽黏膜上皮细胞中阳性表达率分别为36.00%（9/25）、28.00%（7/25）、20.00%（5/25）、4.00%（1/25）,2组间差异有显著统计学意义（P〈0.01）;鼻咽癌中IGF-1R与p-ERK、c-fos、Ki-67蛋白阳性表达呈正相关（P〈0.05）;p-ERK与c-fos、Ki-67蛋白阳性表达呈正相关（P〈0.01）;c-fos和Ki-67蛋白阳性表达呈正相关（P〈0.01）。结论鼻咽癌中IGF-1R蛋白过表达参与调控细胞增殖。