不成熟CD8α+DC经同种白血病抗原冲击后移植物抗白血病效应的体外研究

目的: 观察不成熟CD8α⁺树突状细胞(DC)体外经同种异基因白血病细胞全抗原冲击后的移植物抗白血病(GVL)效应。方法: C57BL/6(H-2^b)小鼠的骨髓细胞以GM-CSF +IL-4 +SCF +Flt3L体外诱导不成熟CD8α⁺DC,第3 d加入0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/LBALB/c(H-2^d)小鼠来源的同种异基因EL9611红白血病细胞抗原冲击,冲击后DC与同系(H-2^b)T细胞按DC/T 1∶1、2∶1、4∶1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况,ELISA法检测上清中IFN-γ和IL-10的含量,LDH释放法检测T细胞对EL9611细胞的杀伤活性。以成熟DC为对照,观察同种异基因不成熟CD8α⁺DC体外对EL9611白血病细胞的GVL效应。结果: 同种红白血病全抗原冲击后不成熟CD8α⁺DC可有效刺激同系T细胞增殖,作用随DC/T比例增加而增加,增殖效应在 小剂量抗原(≤5 mg/L)冲击时更明显(P<0.05);Ag冲击后不成熟CD8α⁺DC刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-10明显增高(P<0.05),IL-10的分泌与不成熟CD8α⁺DC发挥GVL效应存在一定的负相关关系,Ag冲击浓度较低而IL-10分泌少时,T细胞增殖活性较强。杀伤实验结果显示,白血病特异性T细胞对EL9611靶细胞的杀伤活性随抗原冲击浓度的增加而升高,浓度为2.5 mg/L时,杀伤率即可达90%,非特异性杀伤实验显示白血病特异性T细胞对同种异基因正常脾细胞的杀伤活性低于对照组(P<0.05),表明杀伤作用为抗原特异性杀伤,对正常细胞无明显杀伤。结论: 经同种异基因白血病抗原冲击后不成熟CD8α⁺DC体外能刺激同系T细胞产生一定的GVL效应。     

干扰素-α联合GM－CSF诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化

目的：研究干扰素-α（IFN-α）对慢性髓性白血病（CML）骨髓单个核细胞来源的树突状细胞（DCs）发育的影响。 方法： 12例初发慢性期CML患者的骨髓单个核细胞，分别与含如下细胞因子,RPMI-1640培养液共育：rhGM-CSF 1×106U/L联合rhIFN-α 2×106U/L（IFN-α组）、rhGM-CSF 1×10⁶U/L联合rhIL-4 5×10⁵U/L（IL-4组）、单用rhGM-CSF 1×10⁶U/L和单用rhIFN-α 2×106U/L，培养7 d；于第8-10 d，部分孔加入rhTNF-α 5×10⁴U/L。形态学（Wright染色、倒置显微镜）、免疫学（CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR）检测；磷脂酰丝氨酸（PS）转位检测 DCs凋亡情况；荧光原位杂交（FISH）对1例CML进行细胞遗传学分析；混合淋巴细胞反应（MLR）检测刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： CML骨髓单个核细胞经上述细胞因子诱导7 d后，IFN-α组和IL-4组均呈现树突状细胞的典型形态；免疫学鉴定，IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05），经5×104U/L rhTNF-α作用后，两组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR进一步上调，其中IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05）；经FISH证实来源于白血病细胞；两组DCs均具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，IFN-α组刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于IL-4组(P<0.05)。 结论： IFN-α可促进CML骨髓单个核细胞来源的树突状细胞的分化、活化。这可能是IFN-α在CML中的治疗机制之一。     

肝癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的制备与活化

目的: 探讨制备肝癌树突状细胞(DCs)瘤苗和体外诱导DCs活化的优化方法。方法: 取健康人新鲜血50mL, Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC), 制备肝癌细胞冻融抗原, 采用不同因子组合培养PBMC, 诱导和激活DCs, A组: rhGM-CSF+IL-4; B组: rhGM-CSF+IL-4+冻融抗原负载;C组:rhGM-CSF+IL-4+TNF-α; D组: rhGM-CSF+IL-4+TNF-α+冻融抗原负载。结果: 各组均诱导出DCs, 并高表达CD11c和CD54, 冻融抗原可明显上调CD86、CD80、HLA-DR表达和IL-12 p40分泌(P<0.01), TNF-α促进CD86表达的作用更显著, 但对IL-12分泌无影响, 依次用TNF-α诱导和冻融抗原负载可进一步促进CD86表达和IL12 p40分泌(P<0.05)。CD54和HLA-DR双标记免疫细胞化学染色显示, 各组DCs大多为CD54⁺。表达HLA-DR的DCs均为CD54⁺HLA-DR⁺, 其中, A组CD54⁺HLA-DR⁺细胞数量最少, D组最多, 平均每个细胞HLA-DR的表达水平也与此对应。结论: 采用rhGM-CSF、IL-4诱导的未成熟DCs, 依次使用TNF-α刺激与肝癌细胞冻融抗原修饰可有效促进DCs的活化与成熟。     

通过肿瘤致敏的DCs活化的CD8+ T细胞可有效地杀死肿瘤细胞

目的：探索肿瘤裂解物负载的DCs诱导活化的初始T细胞介导细胞免疫及活化的T细胞杀死肿瘤细胞的能力。方法:应用黏附法分离外周血中的淋巴细胞和单核细胞,应用GM-CSF+IL-4刺激单核细胞并诱导为iDCs,然后进行分组，应用相应的细胞因子等刺激iDCs转化为mDCs,其中肿瘤裂解物冲击DCs组:冻融抗原负载+TNF-α+IL-1β; 无肿瘤裂解物冲击组: TNF-α+IL-1β。再分别用上述DCs与淋巴细胞进行混合培养以刺激混合淋巴细胞中的T细胞转化为细胞毒性T细胞, 并进行分组, 肿瘤裂解物冲击DCs组: 肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；无肿瘤裂解物冲击DCs组: 无肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；对照组: IL-2+IL-7。结果:成功获得iDCs,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，肿瘤裂解物冲击DCs组mDCs更显著上调CD83，且更有效地刺激淋巴细胞增殖； 肿瘤裂解物冲击DCs组的CTLs也高表达CD95(Fas)且TNF-α和IFN-γ的表达水平显著提高(P<0.05)。结论: 肿瘤裂解物冲击DCs可有效促进T细胞活化、增殖；并显著增强相应CTLs的杀死靶细胞的能力，这为发展DCs+CTLs的免疫治疗肿瘤提供了一种新而且简便的生物治疗模式。     

肾癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的活化

目的: 探索体外诱导DCs活化的方法和制备肾癌树突状细胞(DCs)瘤苗。方法: 制备肾癌细胞冻融抗原；取健康人新鲜血分离外周血单个核细胞(PBMC),应用GM-CSF+IL-4刺激，诱导PBMC为iDCs,然后进行分组，采用不同因子刺激iDCs转化为mDCs,其中Ａ组:冻融抗原负载；Ｂ组: TNF-α+冻融抗原负载；Ｃ组: IL-1β+冻融抗原负载；Ｄ组: TNF-α+IL-1β+冻融抗原负载。 结果:各组均可诱导iDCs的成熟,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，D组DCs 更显著上调CD83和CD54表达(P<0.05)和IL-12分泌(P<0.01)，且D组mDCs更有效地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。 结论: TNF-α+IL-1β与肾癌细胞冻融抗原协同可有效促进DCs成熟、增强诱导淋巴细胞活化的能力。     

同种异基因移植引流淋巴结及外周血T细胞活化分析

目的:研究同种异基因移植早期局部引流淋巴结和外周血T细胞的活化情况。方法:以小鼠前臂皮下非血管化心肌移植为模型,利用流式细胞术分析前臂引流淋巴结及外周血不同T细胞亚群的CD69表达水平。结果:同种异基因移植后72h,引流淋巴结CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均明显高于移植前(P＜0.01),且CD8⁺T细胞的表达水平高于CD4⁺T细胞(P＜0.01);各组外周血CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均无显著差异;局部应用弗氏完全佐剂和全身应用CsA可分别增强和抑制同种异基因移植后CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:局部引流淋巴结T细胞CD69的表达水平可及时反映受者T细胞对同种异基因抗原的识别情况。     

雌激素处理DCs在诱导小鼠同种皮肤移植免疫耐受中的作用

目的：研究雌二醇（17β-estradiol, E₂）处理的供体骨髓来源树突细胞（dendritic cells, DCs）在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的作用。方法：体外培养小鼠骨髓来源DCs，然后用E₂处理。受体小鼠在皮肤移植前经尾静脉分别输注经E₂处理的供体小鼠DCs、供体小鼠成熟DCs以及不成熟DCs，输注PBS为对照组。1周后对受体小鼠进行同种异基因皮肤移植，手术后观察皮肤存活情况，应用流式细胞术检测手术前后受体小鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞百分率的变化。结果：在同种异基因皮肤移植中，受体小鼠尾静脉输注经E2处理的DCs组与对照组和不成熟DCs组比较，移植皮肤存活时间显著延长，较不成熟DCs组存活时间平均延长10.6 d（P<0.01）；与对照组和不成熟DCs组比较，E₂处理组外周血中CD4+CD25+ 调节性T细胞百分率明显升高（P<0.01）。结论：在同种异基因小鼠皮肤移植模型中，E₂处理的供体小鼠DCs可以延长移植皮肤存活时间。     

ManLAM对树突状细胞成熟及下游免疫的影响

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)成分带甘露聚糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan,ManLAM)对树突状细胞(dendriticcells,DCs)成熟及下游免疫的影响。方法:分离健康人外周血单个核细胞,用GM-CSF和IL-4诱导DCs生长,培养至第五天换液加细胞因子,第六天分三组,按实验设计加ManLAM和LPS。第七天收集细胞送流式检测DC-SIGN、HLA-DR、CD86、CD83表达水平;ELISA检测DCs培养上清液中IL-12和IL-10水平;混合淋巴细胞反应检测DCs诱导CD4+T淋巴细胞增值能力;DCs与初始CD4+CD45RA+T细胞共培养48小时后,ELISA检测培养上清液中IFN-γ水平。结果:(1)ManLAM组DCs表达CD86、CD83等成熟标志物较成熟DCs组下降,差异有统计学意义(P0.05);(2)ManLAM组DCs培养上清液中IL-10水平较成熟组升高,IL-12水平较成熟组下降,差异有统计学意义(P0.05);ManLAM组DCs刺激淋巴细胞增殖能力及刺激初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力较成熟组下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ManLAM干扰DCs成熟,下调DCs诱导的淋巴细胞增殖能力和激活初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力。     

CCK-8对LPS诱导树突状细胞成熟的影响

目的: 观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法: 采用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导法培养小鼠骨髓来源DCs,在LPS诱导其成熟过程中用不同浓度的CCK-8进行干预,采用流式细胞分析技术检测DCs表面主要组织相容性复合物II(MHC II)、分化群80(CD80)和分化群86(CD86)的表达;ELISA法检测DCs培养上清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;MTT法检测CCK-8处理DCs对同种异体T细胞增殖反应的影响。结果: CCK-8剂量依赖性地抑制LPS诱导DCs表面CD80、CD86和MHC II表达(P<0.01, P<0.05 );CCK-8抑制LPS诱导DCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α(P<0.01);并且,CCK-8降低LPS诱导DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性(P<0.05,P<0.01)。结论: CCK-8对LPS诱导DCs成熟过程中的细胞表型、细胞因子分泌和抗原提呈功能有抑制作用,提示CCK-8有可能在抗感染和抵抗自身免疫性疾病过程中发挥重要调节作用。     

孕酮对人树突状细胞成熟和免疫功能的影响

目的：研究孕酮（P₄）对人外周血来源树突状细胞（DCs）成熟和免疫学功能的影响。方法：在人外周血来源DCs体外培养时加入两种浓度的P₄ (10-7 mol/L和10-6 mol/L)处理，光镜和电镜下观察DCs的生成情况及形态变化，以流式细胞仪分析各组细胞的免疫表型，用ELISA方法测定其分泌的IL-10和IL-12水平，［3H］-TdR掺入法检测体外混合淋巴细胞反应中DCs刺激同种反应性T细胞的增殖能力。结果：加入P4培养后, DCs树突状和膜面状伪足减少，表达低水平MHC-II分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86，其分泌的IL-10水平升高，IL-12水平明显下降，DCs刺激同种反应性T细胞的功能显著下降。结论：P₄抑制人外周血来源DCs的成熟，对其免疫学功能具有负性调节作用。     

类风湿关节炎CD4+CD28-T细胞与淋巴细胞凋亡的相关性研究

目的: 研究类风湿关节炎(RA)患者外周血CD4⁺CD28^-T细胞比例与淋巴细胞凋亡异常的相关性。方法: 采用流式细胞术三色分析法检测50例患者和50例健康志愿者的外周血淋巴细胞中CD4⁺CD28^-T细胞比例;通过加入PHA孵育检测RA病人外周淋巴细胞和正常对照的淋巴细胞对激活诱导细胞死亡(AICD)易感性差异;分析CD4⁺CD28^-T细胞比例与外周血淋巴细胞凋亡率的相关性。结果: RA组CD4⁺CD28^-T细胞比例的均数明显高于健康对照组(7.79%±3.52% vs 1.89%±1.78%,P<0.05)。RA组病人外周血淋巴细胞的AICD凋亡率低于健康对照组(11.38%±5.73% vs 19.46%±6.32%,P<0.05)。Spearman相关分析结果显示CD4⁺CD28^-T细胞比例与外周血淋巴细胞AICD凋亡率负相关(r=-0.433,P<0.01)。结论: RA患者外周血中CD4⁺CD28^-T细胞比例增多,活化淋巴细胞生存期延长,这可能参与RA的发病机制。     

IL-12基因转染的人树突状细胞加强细胞免疫反应的体外研究

目的:探讨IL-12基因转染的树突状细胞(DCs)能否体外加强细胞免疫反应.方法:脂质体转染(经过Flt-3L、SCF、GM-CSF刺激)增殖周期中的DCs前体细胞.加入GM-CSF、IL-4和TNF-α扩增转染细胞.在流式细胞仪上分析细胞表型及IL-12的表达.成熟DCs装载上分别能与HLA-I 类和HLA-II类分子结合的多肽,观察IL-12基因转染DCs对特异性Th细胞发育及特异性CTL诱导和功能的影响.结果:IL-12基因转染细胞在上述细胞因子作用下发育成为能有效表达IL-12并具有典型形态学与表型特征的DCs.在装载上CD4+T细胞表位HBcAg50-69后,能诱导这些细胞发育成为IFN-γ产生型的Th1细胞.HLA-A201亚型DCs在其同时装载CD4+T和CD8+T细胞相应的表位后,IL-12 基因转染DCs所诱导产生的自身淋巴细胞的CTL效应增强.结论:IL-12基因转染的DCs能增强对Th1细胞的刺激和CTL效应的诱导能力,提示它在肿瘤疫苗发展中的潜力.     

人脐血源性MSCs成骨诱导分化后对DCs的免疫抑制研究

目的探讨人脐血源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood,UCB-MSCs)经成骨诱导分化后,对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的分化、成熟及免疫功能的影响。方法对UCB-MSCs通过细胞形态、表面标记及成骨诱导分化能力进行鉴定;在外周血单核细胞培养体系中加入GM-CSF+IL-4+TNF-α,刺激DCs诱导分化及成熟;收集与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养的DCs,流式细胞仪检测DCs免疫表型的表达情况;将成熟DCs作为刺激因素,外周血淋巴细胞作为反应细胞,3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养后,DCs刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果人UCB-MSCs成骨诱导分化后能抑制DCs表面CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-II的表达,上调CD14的表达;DCs具有明显刺激淋巴细胞增殖的功能,而UCB-MSCs成骨诱导分化后能显著抑制DCs刺激的淋巴细胞增殖。结论成骨诱导分化的UCB-MSCs在体外可抑制同种异体DCs的分化、成熟及免疫功能,为UCB-MSCs作为同种异体源性种子细胞在骨组织工程中的应用提供了依据。     

人外周血单核细胞来源树突状细胞的成熟诱导

目的：探讨诱导树突状细胞成熟的最优方法。方法：以细胞因子GM-CSF和IL-4体外诱导人单核细胞来源的树突状细胞，分别采用CD40L、LPS、TNF-α、细胞因子鸡尾酒法（TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2）诱导成熟，24小时后收获DCs以流式细胞仪检测其成熟表型CD80、CD83、CD86、HLA-DR和FITC-Dextran的内吞能力，ELISA法检测其IL-12的分泌，MTT法检测其刺激淋巴细胞增殖活性。结果：CD40L、LPS、TNF-α、鸡尾酒法均可诱导DCs的成熟，其中以鸡尾酒法诱导成熟的效果最优，CD83的表达率为66.91%（P〈0.05）；成熟DCsFITC-Dextran的内吞能力明显下降；成熟DCsIL-12分泌量明显高于未成熟DCs，其中鸡尾酒法诱导成熟的DCs的IL-12分泌量最高，成熟的DCs有较强的刺激淋巴细胞增殖能力。结论：细胞因子鸡尾酒法是诱导DCs成熟的最佳方法。     

粒细胞集落刺激因子动员对供者外周血细胞树突状细胞亚群的影响

目的：研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员对外周血单个核细胞（PBMNC）中树突状细胞（DC）亚群及其功能的影响。方法：以CD34^-Lin^- HLA-DR⁺细胞群设门4色荧光分析方法检测25例无关供者G-CSF动员前、后外周血细胞DC亚群；ELISA检测其血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4活性，并分析DC₁/DC₂（CD11c⁺CD123^- /CD11c^-CD123⁺）比值与CD34⁺细胞含量的相关性。结果：G-CSF动员后, 供者PBMNC 的DC₁/DC₂比值显著低于动员前（P<0.05）；DC₁/DC₂与CD34⁺细胞含量呈负相关（r=-0.438, P<0.05），CD34⁺细胞/MNC≥0.4%时， DC₁/DC₂倒置；而血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平无显著改变（P>0.05）； DC₂ HLA-DR表达上调而CD83不表达。结论： G-CSF动员后，供者外周血CD34⁺细胞数量增加的同时，DC₂数量也增加，这些DC₂尽管HLA-DR表达上调，但仍处前体细胞状态，不直接分泌或调节Th2细胞分泌免疫抑制因子。     

槲皮素和乙酸龙脑酯对细菌脂多糖诱导流产孕小鼠子宫组织中CD4+/CD8+ T细胞的影响

目的 探讨小鼠子宫组织中CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞在早期胚胎丢失中的意义，研究槲皮素和乙酸龙脑酯对细菌脂多糖（LPS）诱导流产小鼠的保胎效果和对母胎界面免疫平衡的调节作用。 方法 采用LPS尾静脉注射，制造小鼠流产模型，孕4～7d分别口服不同保胎药物，用药前后检测各组（n=10）小鼠子宫组织CD4⁺/CD8⁺T细胞亚群的变化。 结果 LPS促流产后，小鼠子宫壁CD4+T细胞数量显著增多（P<0.01），CD8⁺ T细胞无明显变化（P>0.05），CD4⁺/CD8⁺比值显著升高（P<0.01）。预先口服保胎药物能不同程度抑制LPS的作用。其中以槲皮素和乙酸龙脑酯联合使用组的保胎效果最为明显，CD4^+/CD8⁺比值下降，较LPS流产模型组差异极显著（P<0.01）。 结论 小鼠子宫组织CD4^+/CD8⁺比值升高与早期胚胎丢失关系密切，槲皮素和乙酸龙脑酯能够调节小鼠子宫局部的免疫微环境，从而起到一定的促孕保胎作用。     

人外周血耐受性树突状细胞的诱导培养及其DC-STAMP的表达研究

目的:诱导培养人外周血耐受性树突状细胞(TolDCs)并动态观察TolDCs诱导过程树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP) mRNA的表达水平.方法:(1)免疫磁珠分选法获得人外周血CD14+单核细胞,采用细胞因子GM-CSF、白介素4(IL-4)、地塞米松和LPS联合培养诱导TolDCs;(2)观察培养细胞的形态变化,流式细胞术检测CD83、CD86和CD14的表达,并将培养的细胞与T淋巴细胞共培养观察T淋巴细胞增殖反应;(3)采用实时定量PCR对TolDCs诱导培养过程中DC-STAMP mRNA表达水平进行动态观察.结果:(1) CD14+单核细胞GM-CSF、IL-4、脂多糖诱导培养后胞体变大,出现树枝状突起,为典型的成熟DCs形态,加地塞米松诱导培养后胞体亦变大,但未见明显树枝状突起,缺乏典型的成熟DCs形态;(2)CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后使CD83和CD86表达上调,CD14表达下调,加Dex联合诱导培养后DCs表面CD83、CD86表达下调,CD14表达上调,与T淋巴细胞共培养后增殖反应明显减弱,显示TolDCs的免疫表型和功能特性;(3) CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后DC-STAMP mRNA的表达水平随培养时间延长而降低,加入地塞米松联合诱导后表达水平明显增加.结论:人外周血CD14+单核细胞采用GM-CSF、IL-4和地塞米松联合培养可诱导TolDCs生成,DC-STAMP可能与DCs的致耐受功能有关.     

转JAK2基因脐血CD34+细胞体外扩增与生物学特性研究

目的： 探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和转基因细胞的生物学特征。方法: 构建逆转录病毒载体MGI-F₂JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和2个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(F36v，F₂)。应用MiniMACS磁珠分选系统纯化分离脐血CD34⁺细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34⁺细胞。转染后的CD34⁺细胞在IMDM培养体系中，将细胞分为AP20187组;FL组；TPO组；AP20187+FL+TPO (AFT) 组。对扩增后的细胞定期检测基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养、染色体核型分析和裸鼠致瘤实验。结果: 分选的CD34⁺细胞纯度>91%，基因转移率为49.32%±6.21%；只有AP20187+FL+TPO组可以使转基因的脐血CD34⁺细胞大量增殖，扩增至第8周时细胞数达10⁹，CD34⁺细胞GFP的阳性率由基线水平逐渐上升并于第8周时达到90%以上；细胞表型为CD33⁺、CD61⁺、Gly-A⁺部分阳性；CD38⁺、HLA-DR⁺强阳性；CD2、CD7、CD19接近阴性。扩增的CD34+细胞可分别形成BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix并以CFU-GM集落为主。扩增后CD34⁺细胞检测染色体核型正常，裸鼠实验无致瘤特性。结论: 转染JAK2 基因的人脐血CD34⁺细胞协同FL和TPO细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞，对今后研究细胞信号转导、造血调控以及开展干细胞和基因治疗都有潜在的应用价值。     

早期凋亡的T淋巴细胞诱导生成耐受性树突状细胞的实验研究

目的： 探讨早期凋亡T淋巴细胞的抑制性免疫调节性能。方法： 采用定时紫外线照射诱导T淋巴细胞早期凋亡，深低温反复冻融获得坏死T淋巴细胞。体外诱导、纯化并培养骨髓源性不成熟树突状细胞（imDCs）,imDCs分别和早期凋亡或坏死T淋巴细胞共培养。用流式细胞仪、双夹心ELISA、［³H］掺入混合淋巴细胞反应等方法分析imDCs吞噬早期凋亡或坏死T淋巴细胞后，在不同处理条件下，MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86的表达水平、分泌IL-12 p70以及刺激T淋巴细胞增殖能力的差异。结果： imDCs和坏死细胞碎片共培养后明显趋于成熟，其MHCⅡ和CD40、CD80、CD86的表达水平显著上调；分泌较高水平的IL-12 p70；和同种异体处女T淋巴细胞混合培养后显著刺激处女T淋巴细胞增殖。 imDCs和早期凋亡的T淋巴细胞共培养后,其MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86的表达维持较低水平；仅分泌较低水平IL-12 p70；和同种异体处女T淋巴细胞混合培养后不能刺激淋巴细胞增殖。此外，早期凋亡的T淋巴细胞孵育上清显著抑制了吞噬坏死细胞碎片后的imDCs表达共刺激分子CD40、CD80、CD86。当TGFβ₁中和抗体和早期凋亡T淋巴细胞同加入imDCs，在表达MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86，分泌IL-12 p70，刺激处女T淋巴细胞增殖等方面和吞噬坏死T淋巴细的DCs相比无显著差异。结论： 早期凋亡T淋巴细胞通过释放免疫抑制性细胞因子TGFβ₁，诱导imDCs呈现出耐受性DCs（TolDCs）的免疫表型及生物学特征，从而发挥抑制性免疫调节作用。     

肿瘤抗原联合CD40L致敏树突状细胞诱导CTLs杀伤K562细胞的实验研究

目的：以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导为树突状细胞（DCs），负载K562细胞冻融抗原，并联合CD40L诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对K562细胞的杀伤作用。方法:密度梯度离心法、贴壁法分离健康人外周血单核细胞，应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α等细胞因子诱导扩增，培养DCs，用K562细胞冻融抗原联合rhsCD40L致敏DCs。实验分4组：K562细胞冻融抗原致敏DCs为实验组A，联合CD40L致敏DCs为实验组B，未致敏DCs为对照组A，单核细胞+异体淋巴细胞组为对照组B，观察CTLs对K562细胞的杀伤效应。结果:培养出具有典型特征的DCs，表达CD40最高达96%、CD86达97%、CD80为77%、CD1a为 69%，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为 20∶1 时，实验组A对K562细胞的杀伤率为71.3%，实验组B为86.9%，对照组A为37.6%，对照组B为21.1%。实验组均显示高水平杀伤率，与对照组比较差异显著（P＜0.05），实验组B加CD40L杀伤率高于实验组A（P＜0.05） 。结论：K562细胞冻融抗原冲击致敏DCs能有效诱导T细胞特异性抗白血病作用，联合CD40L能增强其CTL的杀伤作用。