自体骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 通过对受损关节软骨进行未经诱导的兔自体骨髓间质干细胞移植，探讨组织工程移植修复兔关节软骨缺损的效果。方法 取青紫蓝兔股骨骨髓分离间充质干细胞进行培养，采用变性处理及透明质酸盐修饰后的吸收性明胶海绵为载体，实验组用骨髓间充质干细胞修复自体股骨保关节软骨缺损。对照组进行单纯吸收性明胶海绵移植。结果 移植24周后，肉眼下实验组移植物与正常软骨组织难以区分，软骨表面光滑，对照组移植物为白色的疏松组织。光镜下修复组织类似周围正常软骨组织结构，甲苯胺蓝异染与正常软骨组织无区别，为透明软骨组织。对照组24周关节软骨缺损区被纤维软骨样组织修复。结论 自体骨髓间质干细胞移植于受损关节软骨处，可促进关节缺损的修复，恢复软骨组织的结构功能。     

骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损

背景：多肽水凝胶因为其具有良好的可塑型性,能够与损伤部位很好的无缝隙结合,所以采用该材料作为支架是骨、软骨组织工程中一种可行的探索。目的：骨髓间充质干细胞联合新型可注射多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损,观察其修复效果。方法：首先分离培养兔骨髓间充质干细胞,兔左侧膝关节处制备直径5 mm,深3 mm的全层骨-软骨缺损模型;右侧造模后空置作为对照。实验分为3组,单纯自组装多肽凝胶移植组,自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组。采用的成软骨因子包括转化生长因子β1,地塞米松和胰岛素样生长因子1,三者混合后加入到自组装多肽凝胶或骨髓间充质干细胞中。于处理后12周时处死动物行大体及组织学观察、X射线摄片、免疫组织化学法进行组织学评分评估修复情况。结果与结论：单纯自组装多肽凝胶移植在12周后显示出非常好的修复效果,可见番红O染色,Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色强度以及组织学评分明显高于其他组(P <0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组修复效果较好,与自组装多肽凝胶组相似,但其修复区域蛋白聚糖表达比对照组明显升高(P <0.01)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组修复效果不佳,12周未能完全修复缺损区域,与单纯自组装多肽凝胶组比较骨赘的形成有所增加。结果表明,单纯自组装多肽凝胶能够在原位修复骨软骨缺损并促进软骨修复,提示以自组装多肽凝胶支架移植有望提高目前修复软骨缺损的效果。     

骨髓间充质干细胞对股骨头坏死缺损模型修复的组织学观察

目的研究骨髓间充质干细胞在治疗股骨头坏死动物模型的修复作用及价值。方法建立兔双侧股骨头内骨缺损模型，并分为3组，A组为制作缺损而不填充任何材料，B组为单纯填充纳米人工骨，C组填充纳米人工骨和骨髓间充质干细胞的复合材料。对植入后4周、8周、12周的股骨头行组织学检查。结果B组和C组在股骨头缺损修复成骨方面与A组有显著差异，C组差异性更大。结论骨髓间充质干细胞有较强的成骨作用，可促进股骨头坏死骨缺损的修复，对股骨头坏死的治疗有较大价值。     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架

背景:软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织.目的:拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成.材料:日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞.医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品.Ⅰ型胶原为Sigma公司产品.方法:取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架.取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体.主要观察指标:傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况.结果:壳聚糖-胶原支架孔径为160～380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%.傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰.细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合.结论:壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体.     

兔骨髓间充质干细胞与透明质酸钠复合修复软骨的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与透明质酸钠复合修复兔软骨缺损的作用。方法在麻醉下制备18只家兔关节软骨缺损模型,将其随机分成3组。实验组(A组):BM-MSCs/透明质酸钠移植入软骨缺损处;对照组(B组):透明质酸钠移植入软骨缺损处;空白组(C组):不做处理。于移植后第6、12周分别对标本行组织学检测,并对实验数据行改良Pineda法评分,最后进行相关统计学分析。结果 A组为软骨样组织修复,组织学染色为阳性;B、C组软骨缺损处是以纤维组织为主的修复,组织学染色呈弱阳性。A组的修复效果显著优于B、C组,而B、C组之间的修复效果无明显差异。结论移植的BM-MSCs/透明质酸钠复合物可有效促进兔软骨缺损修复。     

骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的:体外培养骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)并以壳聚糖作为组织工程细胞外支架构建组织工程软骨,探讨其在软骨组织工程中的应用.方法:分离兔BM-MSCs并进行体外传代培养.观察细胞形态及其变化,检测免疫表型CD71的表达;绘制并比较不同代次细胞的生长曲线.传代培养后,检测第2、3、4代BM-MSCs的软骨特异性Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)的mRNA的表达.取6只新西兰成年白兔,随机分为两组,A组为单纯壳聚糖支架修复组,B组为壳聚糖支架复合BM-MSCs修复组.分别于术后4、8周处死动物,观察新生区软骨组织修复情况.结果:体外培养获得高纯度且传代能力强的BM-MSCs.修复术后4周,A组仅有纤维组织增生,甲苯胺蓝染色较淡;B组关节软组织缺损处有软骨样组织及胶原生成.术后8周,B组关节软骨缺损处有较明显的软骨组织增生;A组仅在与正常软骨交界处有少量的软骨组织生成;免疫组织化学显示B组ColⅡ有表达.结论:密度梯度离心法联合差速贴壁法能提高BM-MSCs的纯度,通过该途径获得的BM-MSCs可作为软骨组织工程的种子细胞.壳聚糖是比较理想的新型软骨组织工程支架,以BM-MSCs复合壳聚糖构建的组织工程软骨能够较好地修复兔关节软骨缺损.     

巢式PCR扩增性别决定基因序列检测兔骨髓间充质干细胞移植治疗关节软骨缺损的修复组织来源

目的：明确骨髓间充质干细胞移植到关节软骨损伤处后，该处修复组织的细胞来源，以了解组织修复的过程。方法：实验于2006—01／2007—01在浙江省医学科学院生物工程所完成。①实验材料：3月龄新西兰大白兔，清洁级，体质量约2kg，由浙江省实验动物中心提供。（爹实验方法：利用兔性别决定基因序列设计两对PCR引物。取雄性新西兰大白兔进行骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增。取雌性新西兰大白兔，暴露其膝关节软骨，用电钻钻孔造成膝关节软骨内侧直径4．5mm深3．5mm的全层关节软骨缺损，达软骨下骨。一侧植入骨髓间充质干细胞，胶原海绵，另一侧仅植入胶原海绵。⑧实验评估：于术后1，2，3，4，5个月取兔关节软骨缺损修复处组织提取总DNA，进行PCR扩增，鉴定移植物中是否存在性别决定基因，以明确细胞来源。结果：移植后1，2，3，4，5个月移植雄兔骨髓间充质干细胞及胶原海绵的关节修复处组织提取的DNA，用设计的引物通过PCR扩增出一条约200bp大小的条带，大小与阳性对照一致；而另一侧仅移植胶原海绵的关节软骨修复处组织提取的DNA，用设计的引物通过PCR扩增后未发现有条带。PCR扩增阳性样本测序分析显示，每个样本碱基序列一致，与GenBank上性别决定区Y基因组gb｜AY785433．1｜比较，扩增的样本序列与标准序列完全一致，序列同源性达100％。结论：雌兔关节骨髓间充质干细胞，胶原海绵复合物移植处的新生组织中含有雄性组织，提示新生软骨中有移植的雄性骨髓间充质干细胞分化来的软骨细胞。     

Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损

研究表明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原都有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和分化.目的:观察Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法:取24只新西兰大白兔制作双膝股骨滑车直径3.8 mm、深2 mm关节软骨缺损模型,分为2组:实验组缺损区植入Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物,对照组缺损区植入单纯Ⅰ/Ⅲ型胶原膜.结果与结论:膝关节股骨标本组织学染色显示,实验组植入8周时为类透明软骨修复,12周时接近于正常软骨;对照组植入8周时以纤维样组织修复为主,12周时为纤维软骨修复.实验组植入后8,12周组织学评分均明显高于对照组(P<0.001).表明运用Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物可修复关节软骨缺损.     

异种去蛋白松质骨复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损的组织学变化

背景:目前应用各种人造支架复合细胞修复骨缺损研究很多,但是各种人造支架都没有骨的天然结构,所以修复效果不够理想.目的:将大鼠骨髓间充质干细胞接种到异种去蛋白松质骨上,移植修复大鼠股骨节段性缺损,以体内修复效果来评价复合体应用前景.方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并进行扩增,用BrdU体外进行标记.同时制备牛去蛋白松质骨,在体外与标记后的细胞复合.制备大鼠双侧股骨中段5 mm缺损模型,实验分成3组,缺损处分别移植骨髓间充质干细胞/去蛋白松质骨复合体、单纯去蛋白松质骨及单纯骨髓间充质干细胞.结果与结论:BrdU免疫染色结果显示,在各组细胞均呈阳性表达,但随着移植时间的延长而减弱.X射线放射学评分及苏木精-伊红染色组织学评分结果显示,各时间段复合体组成骨效果均好于其他组.复合体组Ⅰ型胶原蛋白表达随着时间的延长有明显增强,强于其他组.提示骨髓间充质干细胞复合异种去蛋白松质骨的成骨能力明显强于单纯的支架修复能力,单纯的骨髓间充质干细胞虽然有成骨能力,但不能修复节段性骨缺损.     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景:骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力.目的:验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限.方法:①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞.实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照.②取20只兔.建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组.实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞:空白对照组植入生理盐水.分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测.主要观察指标:①细胞形态学.②碱性磷酸酶活性的测定.③大体标本观察.④X射线观察.⑤组织切片观察.结果:①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态.②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P＜0.05).③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清:X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善:组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致.结论:自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤.     

骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞体内移植修复软骨缺损

背景:以往主要采用磨削灌洗、钻孔、微骨折技术等对软骨缺损组织进行修复,但多数技术被认为具有一定的局限性,只能减轻患者疼痛或仅短期有效。近年来越来越多的研究表明,软骨组织工程修复技术对于软骨再生及修复具有重要意义。目的:观察自体骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞修复兔膝关节髁间窝软骨缺损的效果。方法:取新西兰大白兔28只,随机均分为两组,建立双侧膝关节髁间窝关节软骨缺损模型,实验组左侧植入自体骨膜与骨髓间充质干细胞-软骨细胞复合物,右侧不植入任何材料作为空白对照;对照组左侧植入自体骨膜,右侧不植入任何材料作为空白对照。术后第8,12周,取膝关节软骨缺损部位新生组织,行大体、组织学观察及Wakitani评分。结果与结论:术后12周,实验组修复组织表面基本光滑,与周围软骨色泽极其相近,出现大量软骨细胞及软骨陷窝,形成软骨基质,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,甲苯胺蓝染色较深;对照组修复组织仍为白色,新生修复组织局部凹陷,表面欠光滑,质地较硬,仅有极少量软骨细胞,甲苯胺蓝染色较浅,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,无软骨基质形成;空白对照组软骨缺损塌陷,表面不规则,修复组织为纤维组织,甲苯胺蓝染色较浅。表明自体骨膜复合骨髓间充质干细胞与软骨细胞移植能够较好修复关节软骨缺损。     

自体骨膜复合骨髓间充质干细胞移植修复免关节软骨缺损

背景:自体骨髓间充质干细胞及骨膜移植等方法可促进关节软骨缺损的修复,但其各自的成软骨能力有限,治疗效果欠佳.目的:观察自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植修复软骨缺损的疗效.设计、时间及地点:随机分组对照动物实验,于2005-08/2007-03在山西医科大学第二医院骨科实验室完成.材料:6～8月龄新西兰白兔18只,按随机数字表法分为3组,即骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组及空白对照组,每组6只12个膝关节标本.方法:骨膜复合骨髓间充质干细胞组采用胰酶消化法采集骨髓间充质干细胞进行贴壁培养,加入转化生长因子β1向软骨细胞进行诱导分化,同时进行PKH-26细胞膜免疫荧光标记.在全部兔双侧股骨内侧髁造成直径3 mm,深度3 mm的全层软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组取同侧胫骨上段内侧骨膜,骨膜生发层朝向骨髓腔覆盖软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组先期缝合3针,向缺损区注入1×109L-1骨髓间充质干细胞细胞悬液20μL,植入细胞后缝合最后1针.单纯骨膜组只进行单纯骨膜覆盖缺损处理;空白对照组只钻孔不作任何处理.主要观察指标:术后6,12周时,对缺损部位进行大体观察、组织学观察、Wakitani评分以及Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交检测.结果:所有缝合骨膜未发现脱落,骨膜复合骨髓间充质干细胞组6周时,软骨缺损已由透明软骨样修复组织填充,12周时修复组织进一步改建,且修复组织中细胞主要为带有PKH-26荧光标记的植入细胞.单纯骨膜组缺损区修复组织为乳白色,表面光滑稍微凹陷,与周围正常软骨组织之间界限清晰;空白对照组缺损区多数比较凹陷,或缺损部位形状不规则,周围软骨组织断裂.术后6,12周时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组Wakitani组织学评分均优于单纯骨膜组和空白对照组(P＜0.05),单纯骨膜组的评分优于空白对照组(p＜0.05).同时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组修复组织内细胞周围基质Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交染色阳性,证实修复组织内的细胞为植入细胞.结论:自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植可形成透明软骨样修复组织修复关节软骨缺损.     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景:以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度.基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破.目的:进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复.方法:从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中.实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞.术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况.结果与结论:体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生.透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨.透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组.组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组.提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复.     

组织工程化软骨细胞和骨髓间充质干细胞用于修复同种异体关节软骨缺损

背景:关节软骨几乎没有自身修复的能力,目前临床大多采用自体或异体软骨移植修复、软骨膜或骨膜移植修复、软骨细胞移植修复。由于自体软骨来源有限,异体软骨又存在慢性免疫排斥反应,最终可能导致预后不佳;软骨膜或骨膜移植修复的软骨易于退化,导致修复效果不佳。目的:总结组织工程化软骨细胞、骨髓间充质干细胞及两者共培养对同种异体软骨缺损修复作用的研究现状。方法:应用计算机检索PubMed数据库及中国期刊网全文数据库1994-01/2012-01有关组织工程化软骨细胞和骨髓间充质干细胞用于修复同种异体关节软骨缺损方面的文章,英文检索词为"cartilage defect,allograft,chondrocyte,mesenchymal stem cells,bone marrow mesenchymal stem cells",中文检索词为"软骨缺损,同种异体移植,软骨细胞,骨髓间充质干细胞"。排除重复性及非中英文语种研究,共保留35篇文献进行综述。结果与结论:随着体外细胞培养方法的不断改进,现已能够把软骨细胞从坚韧的软骨中分离出来,并获得大量高纯度的软骨细胞并繁殖出新生软骨细胞。软骨细胞培养增殖能力低,传代培养容易引起老化和去分化;而成体骨髓中骨髓间充质干细胞含量少,随传代次数的增多成软骨潜能明显降低。骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养,两种细胞相互促进增殖和分化,作为种子细胞可减少软骨细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量,与组织工程支架材料复合能有效修复关节软骨缺损。     

基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤

背景：随着生物技术的发展,通过转基因技术修饰细胞,从而获得长期稳定表达的生物活性因子以治疗关节软骨损伤逐渐引起重视。目的：就基因修饰的骨髓间充质干细胞在修复关节软骨损伤中的应用作一综述。方法：由第一作者检索1990至2011年PubMed数据库（http：／／www．ncbi．nlm．nih.gov／PubMed）有关基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤的文献,英文检索词为“cartilage,genetherapy,mesenchymalstemcells,tissueengineering,bioactivefactor,vector”。共纳入15篇文献归纳总结。结果与结论：骨髓间充质干细胞已被广泛应用于修复关节软骨损伤。通过转基因技术将特定外源基因导入骨髓间充质干细胞,联合细胞治疗和基因治疗可达到更好的治疗效果,在关节软骨损伤的治疗中有广阔的应用前景。     

骨髓间充质干细胞复合异体骨修复松质骨缺损*

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞及异体骨可促进骨缺损的修复,但骨髓间充质干细胞复合异体骨对于松质骨缺损的修复效果至今少有报道。目的：观察骨髓间充质干细胞复合异体骨修复兔松质骨缺损效果。方法：在新西兰大白兔双侧股骨外侧髁造成0.6 cm×1.2 cm 的松质骨缺损,一侧设为模型组,骨缺损处植入复合骨髓间充质干细胞的异体骨,另一侧设为对照组,单纯植入异体骨。结果与结论：植入后4,8,12周,大体观察、X 射线检查和苏木精-伊红染色观察结果显示,模型组在新骨成长方面,缺损区修复方面均优于对照组。植入后12周,模型组骨缺损区可见大量骨小梁形成及成熟的板层骨组织,骨缺损基本修复。对照组骨缺损区仅可见大量编织骨形成,骨缺损尚未得到有效修复。模型组Lane-Sandhu 法 X 射线结合组织学观察评分高于对照组(P <0.05)。生物力学检测结果显示,植入后12周,模型组股骨髁最大压力载荷、载荷/应变比值均高于对照组(P <0.05),最大应变位移较对照组低(P <0.05)。结果证实,骨髓间充质干细胞复合异体骨可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,且修复效果明显优于单纯异体骨移植。     

独活寄生汤结合骨髓基质干细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损

背景:实验表明,骨髓基质干细胞复合脱细胞真皮基质能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量.目的:进一步验证独活寄生汤对骨髓基质干细胞复合体修复兔关节软骨缺损的影响,评价修复效果.方法:取兔骨髓基质干细胞进行体外增殖后,复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上,植入到兔膝关节软骨缺损,并以中药独活寄生汤灌胃为独活寄生汤+干细胞组,并设立独活寄生汤组、单纯复合体组、空白组为对照组.于4,8,12周后分别对修复组织进行形态学观察及组织学检查.结果与结论:术后12周, 独活寄生汤+干细胞组的缺损由透明软骨样组织充填,软骨及软骨下骨组织基本修复,修复的软骨组织在组织形态学上优于其他各组.结果证实,骨髓基质干细胞复合体能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量.