P21活化激酶1小分子干扰RNA对胃癌BGC823细胞生长的影响

目的观察Pak1siRNA对胃癌BGC823细胞生长和细胞周期的影响。方法 Westernblot检测Pak1在胃癌细胞中的表达。BGC823细胞转染Pak1siRNA后,MTT分析和细胞计数观察BGC823细胞的生长情况,同时进行细胞周期测定。结果 Pak1在胃癌BGC823细胞中高表达,且能被Pak1siRNA干扰达72.24%。BGC823细胞在转染Pak1siRNA后,生长明显受到抑制(P<0.05),细胞周期在G2/M期发生阻滞,转染Pak1siRNA组G2/M比率[(20.12±1.64)%]较对照组[(8.70±1.69)%,P=0.008]明显升高。结论 Pak1siRNA能够影响细胞周期,从而抑制胃癌BGC823细胞的生长。     

低氧诱导因子-1α对肺癌生长影响的研究

目的:研究抑制低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对肺癌细胞体内生长的影响并探讨可能机制。方法:以小RNA干扰(siRNA)表达质粒抑制A549肺癌细胞的HIF-1α表达,建立稳定表达细胞株并接种于裸鼠,观察肿瘤生长情况,TUNEL法检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖。结果:抑制HIF-1α表达可加速肿瘤生长,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的发生,降低糖酵解关键基因的表达。结论:HIF-1α在低氧环境下可能通过上调糖酵解基因表达促进糖酵解,改变细胞生长环境,促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。     

棉酚衍生物ApoG2诱导胃癌细胞凋亡及对Wnt6调控作用的研究

目的研究棉酚衍生物ApoG2诱导胃癌细胞凋亡作用及对wnt6调控作用的影响。方法以人胃腺癌细胞系BGC823细胞为模型,检测ApoG2作用下BGC823细胞生长抑制、形态学变化和细胞周期变化,以及给药前、后细胞Bcl2、Bax和BakmRNA表达水平和Wnt6蛋白表达水平的变化。结果ApoG2对BGC823细胞的生长抑制呈浓度依赖性,给药后经Hoechst染色可观察到典型凋亡细胞,经PI染色用流式细胞仪可检测到明显sub—G1峰;Wnt6蛋白含量和Bcl2mRNA含量随ApoG2浓度升高而降低,Bax和BakmRNA含量随ApoG2浓度升高而升高。结论ApoG2能明显抑制人胃癌细胞BGC823的生长,诱导细胞凋亡,可能通过抑制细胞wnt6蛋白表达从而调控Bcl2蛋白家族的基因转录,继而引起细胞凋亡。     

低氧对人肺腺癌A549细胞生长的影响

目的：研究低氧对体外培养的人肺腺癌细胞株A549生长、细胞周期和凋亡的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞技术观察低氧不同时间对人肺腺癌A549细胞株生长、细胞周期和凋亡的影响。采用免疫细胞化学方法检测bcl—2和caspase-3表达。采用半定量RT—PCR法分析低氧对细胞内缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA的影响。结果：MTr结果显示低氧12、24、48h后，A549细胞生长受到抑制。流式细胞技术检测显示低氧12、24、48h后，G1／G0期的A549细胞增多，相应的S期细胞减少，同时A549细胞凋亡明显增多。免疫细胞化学结果显示随着低氧时间的延长，bcl-2表达减少，而easpase-3表达增加。RT—PCR检测HIF-1α mRNA的结果显示12、24、48h低氧组HIF-1α mRNA水平均较相应的常氧组增加（P〈0．05）。结论：低氧环境可抑制A549细胞增殖，使细胞周期阻滞于G。／G0期，并促进细胞凋亡，其作用可能是由于低氧环境影响HIF—1α mRNA水平及通过调节bcl—2和caspase-3的表达诱导细胞凋亡而实现。     

低氧对人白血病细胞株K562细胞增殖及HIF-1α表达的影响

目的:探讨在模拟低氧环境下人白血病细胞株K562细胞增殖及低氧诱导因子(HIF-1α)表达的变化。方法:将白血病细胞株分为低氧处理组和常规对照组。对常规对照组细胞株进行常氧培养;对低氧处理组用二氯化钴(CoCl_2)50、200、400、800μmol/L进行处理;在24、48和72 h后收集两组细胞,并在倒置相差显微下观察细胞的形态变化,应用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,实时荧光定量PCR检测HIF-1α在转录水平的表达。结果:K562细胞形态在模拟低氧环境下随CoCl_2的浓度的增高和处理时间的延长而发生变形甚至细胞破裂等变化。MTT实验结果显示,细胞增殖在低氧环境下受到抑制,并且抑制作用随CoCl_2的浓度增加和作用时间的延长而增强(r浓度=0.8712,r时间=0.6785)。荧光定量PCR检测结果显示,细胞株的HIF-1αmRNA表达水平在CoCl_2模拟低氧环境中均有上调,并且对低氧时间和浓度呈依赖性,与CoCl_2的处理浓度及处理时间呈正相关(r=0.954,r=0.895)。结论:低氧环境可抑制白血病K562细胞的增殖并且使细胞中的低氧诱导因子HIF-1α的表达上调,但未导致细胞发生诱导分化。     

沉默缺氧诱导因子-1α对卵巢癌化疗敏感性的影响

目的观察沉默缺氧诱导因子HIF-1α对卵巢癌细胞化疗敏感性的相关影响并探讨其机理。方法构建HIF-1α基因短发夹RNA真核表达质粒,并转染卵巢癌细胞SKOV3（人卵巢浆液性囊腺癌细胞株）。实验可分为空白组,非特异对照组（转染pNonspecific-siRNA,即SKOV3NS）,目的siRNA组（转染pHIF-siRNA,即SKOV3siRNA）3组,用RT-PCR及Western Blot法分别检测各组HIF-1α基因的mRNA和蛋白的表达水平。细胞经过20μmol/L顺铂作用后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术（FCS）检测细胞凋亡率。结果 SKOV3siRNA转染组HIF-1α基因在mRNA水平和蛋白水平表达均明显降低,SKOV3siRNA组肿瘤细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显增高（P〈0.05）。结论 RNA干扰技术沉默HIF-1α能够有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达,增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RNA干扰HIF-2α基因对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制缺氧诱导因子(hyposia-inducible factor 2α,HIF-2α)基因表达对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响。方法:构建针对HIF-2α-siRNA并转染A549细胞株,采用实时荧光定量多聚酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot方法检测HIF-2α表达水平,通过Tran-swell试验及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白检测,探讨HIF-2α-siRNA对A549细胞侵袭力的影响。结果:将HIF-2α-siRNA转染A549细胞后,HIF-2α的mRNA和蛋白表达水平均下调。qRT-PCR检测显示,第4号siRNA表达载体抑制作用最强,转染后24 h和48h对HIF-2α基因mRNA表达水平抑制率分别为(60.63±5.10)%和(80.00±3.55)%。Western blot检测同样证实,第4号siRNA表达载体对于HIF-2α蛋白表达抑制作用最强,转染后24 h和48 h抑制率分别为(31.69±11.56)%和(82.87±4.09)%。Transwell试验发现,转染HIF-2α-siRNA后,穿膜细胞数显著减少(P<0.05),表明细胞侵袭力下降。转染HIF-2α-siRNA后,VEGF表达水平显著下调(P<0.01)。结论:转染HIF-2α-siRNA可有效降低A549细胞的侵袭转移力。     

人胃癌细胞BGC823中miR-200c靶基因产物波形蛋白的检测及功能研究

目的:采用RNA靶向干扰技术,研究人胃癌细胞BGC823中微小RNA(microRNA, miRNA, miR)-200c的靶点锌指E盒增强子结合蛋白2(zinc finger E-box enhancer binding protein 2, ZEB2)基因的表达情况,并检测相关的波形蛋白基因表达情况,观察miR-200c对胃癌BGC823细胞功能的影响。方法:构建ZEB2基因表达的干扰质粒shZEB2,用Lipofectamine 2000转染胃癌BGC823细胞,用G418筛选稳定转染细胞株,进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测人BCG823细胞中ZEB2 mRNA、miR-200c及波形蛋白基因的表达水平,并用蛋白印迹法检测ZEB2蛋白、波形蛋白表达水平,噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)法检测细胞增殖能力;Transwell小室检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果:干扰ZEB2分子表达后,miR-200c表达水平增高,而BGC823细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降。结论:ZEB2是miR-200c的检测靶点,干扰ZEB2后,胃癌细胞BGC823的增殖、迁移及侵袭能力明显降低。     

细胞粘附肽(RGDS)抑制人胃癌细胞BGC823生长及诱导其凋亡

目的 研究细胞粘附肽(RGDS)对人胃癌细胞系BGC823(Human stomach cancer BGC823)生长增殖的影响,进而探讨RGDS诱导BGC823细胞凋亡的作用.方法 用不同浓度的RGDS处理BGC823细胞48 h后,MTT法检测RGDS对BGC823细胞生长增殖的抑制作用,通过HE染色、透射电子显微镜、免疫组织化学、流式细胞术和凋亡细胞的DNA片断等方法观察凋亡细胞的形态结构变化以及定性、定量检测细胞凋亡.结果 RGDS能抑制BGC823细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;RGDS诱导BGC823细胞凋亡的作用机制可能通过抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表达引发这一途径.结论 RGDS能够通过诱导BGC823细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖.     

低氧诱导因子抑制剂对白血病细胞株HIF-1α和VEGF表达及诱导细胞凋亡作用的研究

本研究探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人急性白血病病细胞低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节及诱导细胞凋亡作用。应用DAPI染色检查凋亡细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测K562、U937、Jurkat白血病细胞株hif-1α和vegf mRNA表达以及YC-1对U937细胞hif-1α、vegf mRNA表达影响;Western blot检测YC-1对U937细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达,以及BAX、BCL-2、caspase-3蛋白变化,分析YC-1诱导U937细胞凋亡的可能机制。结果表明:在3种白血病细胞株均可见hif-1α和vegf mRNA表达。4μmol/L YC-1处理U937细胞(0、8、16和24小时)后,可见凋亡细胞出现的典型凋亡形态特征;流式细胞术检测的细胞0、8、16和24小时凋亡率分别为(4.87±0.70)%、(27.27±2.00)%、(51.53±2.81)%及(60.5±3.20)%;vegf mRNA表达下调,而hif-1αmRNA表达无明显变化;HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和BCL-2蛋白表达下调,而BAX和caspase-3蛋白表达上调,BAX/BCL-2比率升高并呈时间依赖性(r=0.973,p0.01)。结论:3种白血病细胞株均显示hif-1α和vegf mRNA表达,YC-1可以抑制白血病细胞HIF-1α蛋白表达,进而下调VEGF,并通过上调BAX/BCL-2比率、caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。     

SPK调节低氧诱导白血病细胞增殖及糖代谢的实验研究

目的:应用人红白血病TF-1细胞系模型,研究SPK信号通路在细胞增殖和糖代谢中的作用。方法:应用慢病毒介导的shRNA干涉策略,干涉TF-1细胞中SPK的表达。通过RT-q PCR和蛋白印迹技术检测SPK在TF-1细胞中干涉效率。应用CCK-8测定细胞增殖活力,通过流式细胞仪检测Annexin V染色确定细胞凋亡情况。结果:低氧能够诱导TF-1细胞中HIF-1α、HIF-2α和SPK的上调,证明SPK是低氧诱导表达的重要分子。SPK-shRNA转染能够明显抑制TF-1细胞的增殖并且诱导TF-1细胞的凋亡。SPK敲减明显减低细胞葡萄糖的利用和消耗。结论:SPK是参与调节低氧诱导细胞增殖和葡萄糖代谢的关键信号分子,在低氧诱导细胞反应中发挥重要作用。     

siRNA下调VEGF基因沉默对人舌癌细胞株Tca8113的生物学作用

目的利用siRNA干扰技术特异性抑制人舌癌细胞株Tca8113的VEGF基因表达,旨在对口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成的基因治疗提供理论依据。方法体外构建两对针对VEGF基因的siRNA重组质粒,利用脂质体转染法导入Tca8113细胞内,MTT法观察转染后的Tca8113细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率的改变,RT-PCR技术和western Blot法检测VEGF蛋白表达量。结果本研究设计的两个靶位点siRNA能有效抑制Tca8113细胞增殖,流式细胞术结果显示G0/G1期细胞阻滞,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞凋亡率增高。VEGF基因蛋白表达率降低,与对照组相比,差异有统计学意义P0.01。结论体外构建siRNA可特异有效的下调VEGF基因蛋白表达。瞬时转染siRNA可不同程度的抑制Tca8113细胞增殖和诱导凋亡。为口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成基因治疗提供理论依据。     

特定沉默胶质瘤U251细胞株的PDGF-B基因对细胞凋亡和增殖的影响研究

目的利用RNA干扰基因治疗技术,特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板衍生生长因子B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法用血清培养液(含10%胎牛血清DMEM培养基)体外培养人U251脑胶质瘤细胞系。随机分为3组,第1组为实验组:转染siRNA的细胞,第2组为阴性对照组:转染空白质粒的细胞;第3组为空白对照组:细胞常规培养不予以干预。利用脂质体将siRNA转染进入U251细胞,在细胞内形成双链siRNA,识别并降解PDGF-B mRNA。通过RT-PCR检测U251细胞中PDGF-B基因mRNA的表达水平,Western blot检测PDGF-B的蛋白表达,MTT法检测U251细胞的增殖情况,流式细胞学对比检测3组细胞的凋亡情况。结果利用脂质体将靶向PDGF-B基因siRNA转染进入U251细胞,48 h后利用RT-PCR检测PDGF-B基因mRNA的表达,结果显示与阴性对照组和空白对照组对比,转染组PDGF-B基因mRNA表达水平明显下降;转染72 h后,Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%);MTT结果显示siRNA转染组U25细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测显示,与阴性对照组和空对照组相比,转染siRNA的细胞的实验组中,G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达,能够使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制胶质瘤细胞的增殖,并促进细胞的凋亡。结论构建靶向胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,通过体外试验观察可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,其所产生的RNA干扰效应对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长的抑制和促进凋亡作用。     

重组人血管内皮抑素联合顺铂体外干预人胃癌细胞生长的研究

目的研究重组人血管内皮抑制素（恩度）联合顺铂对人胃癌细胞株BGC823和SGC7901增殖及凋亡的影响,并探讨其抑制增殖及诱导凋亡的机制。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度顺铂单药（单药组）及其与恩度联合应用（联合组）对BGC823和SGC7901细胞的增殖抑制率;采用流式细胞术分析凋亡细胞比例;采用Westernblot法分析增殖相关蛋白Ki-67及凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化。结果联合组对BGC823和SGC7901细胞的抑制率明显高于单药组;流式细胞术结果表明,正常对照组、单药组和联合组细胞的早期凋亡率依次增加;与单药组比较,联合组Ki-67、Bcl-2基因（蛋白）表达率显著降低。结论与顺铂单独应用相比,恩度联合顺铂对BGC823和SGC7901细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡能力均明显增强。     

HIF-2α基因与人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的关系

目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2 alpha,HIF2α）基因表达后,人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的变化.方法：构建靶向HIF-2α基因的siRNA真核表达载体并转染A549细胞,采用Reαl-time PCR检测HIF-2α mRNA的表达,采用Western blotting检测HIF-2α及多药耐药基因1（multidrug resistance-1,Mdr-1）蛋白的表达,采用MTT法检测顺铂处理后细胞的存活率.结果：在HIF-2α siRNA转染A549细胞后24、48 h后,HIF-2α在mRNA和蛋白水平的表达与空白对照组相比均显著下调（均P＜0.01）,Mdr 1蛋白的表达水平也明显降低（均P＜0.05）.与空白对照组相比,HIF-2α siRNA组细胞对顺铂的敏感性明显增加,各时间点的IC50值均显著降低,差异有统计学意义（均P＜0.01）.结论：靶向HIF-2α的siRNA表达载体能够有效抑制HIF-2α基因的表达,从而逆转A549细胞对顺铂的化疗耐药性.     

门冬酰胺酶对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株凋亡的诱导作用及其相关机制

目的:探讨门冬酰胺酶对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株增殖、细胞周期和凋亡的影响及其作用机制。方法:应用CCK-8法检测门冬酰胺酶对DLBCL细胞株细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测分析细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测细胞凋亡及其凋亡机制。结果:门冬酰胺酶明显抑制多种DLBCL细胞株的增殖,并引起细胞周期G_0/G_1期阻滞;门冬酰胺酶可以降低DLBCL不良预后相关分子HIF-1α的表达,诱导DR4、caspase 8等的活化,抑制c-FLIP表达;同时升高促凋亡蛋白BAX的表达,降低抗凋亡蛋白MCL-1的表达。结论:门冬酰胺酶抑制DLBCL细胞增殖,引起G_0/G_1期细胞阻滞;并通过内源性和外源性细胞凋亡通路诱导DLBCL细胞凋亡。     

小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响

目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。     

靶向封闭再生基因Ⅰα对胰腺癌细胞SW1990增殖行为的影响

目的 观察靶向封闭再生基因Ⅰα(REG Ⅰα)对胰腺癌细胞株SW1990增殖行为的影响.方法 设计并体外合成靶向REG Ⅰα的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后REG Ⅰα基因表达的变化.采用MTT法检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞技术检测细胞周期的变化.结果 REG Ⅰα siRNA转染胰腺癌细胞SW1990后,明显抑制REG Ⅰα基因表达,以200 nmol/L REG Ⅰα siRNA对REG Ⅰα基因表达抑制效果最佳.以该浓度的REG Ⅰα siRNA转染SW1990细胞后,SW1990细胞在siRNA转染后48 hREG Ⅰα mRNA表达抑制率最高,达82%;干扰后SW1990中REG Ⅰα蛋白表达也明显下调.抑制SW1990细胞中REG Ⅰα的表达后,SW1990细胞的增殖能力明显下降,与阴性对照组(转染无关序列的siRNA)及空白对照组(无任何处理)相比,差异有统计学意义(P<0.05).转染细胞的周期分布有明显改变:G1期细胞增加,S期细胞减少.结论 靶向封闭REG Ⅰα基因能明显抑制胰腺癌细胞SW1990在体外的增殖能力,为探索胰腺癌基因治疗提供新的策略.