慢病毒载体对HIF-2α基因沉默效率的研究

目的 构建有效抑制HIF-2α基因表达的siRNA序列,并找到最佳病毒载体浓度.方法 设计针对HIF-2α mRNA作用的4条siRNA的序列,分别插入慢病毒载体中,获得较高滴度的慢病毒后,运用RT-PCR和Werstern blot方法检测HIF-2α mRNA及蛋白质水平,筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量.结果 4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(P<0.05).两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(P＜0.05).结论 KD2序列能有效沉默HIF-2α基因;高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强.     

HIF-1α靶向RNAi慢病毒载体的构建及对Panc-1细胞HIF-1α抑制作用的研究

目的：构建针对缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,并研究其对胰腺癌Panc-1细胞HIF-1α基因表达的抑制作用。方法：针对HIF-1α基因序列设计合成4条shRNA片断并构建RNAi慢病毒载体,同时构建HIF-1α基因过表达质粒。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot进行外源筛靶。将外源筛靶成功的干扰质粒psc1516进行慢病毒包装,再感染Panc-1细胞,Western blot和荧光定量PCR检测沉默前后Panc-1细胞中HIF-1α的蛋白及mRNA的表达。结果：经PCR及测序证实4种干扰载体及1种过表达载体构建成功,Western blot外源筛靶显示4个靶点均能有效敲减目的基因的表达。细胞试验表明psc1516干扰载体能有效抑制Panc-1细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白的表达,当MOI=4时,对HIF-1αmRNA的抑制率为87.4%,蛋白抑制率达90.0%以上。结论：RNAi慢病毒载体可有效地抑制胰腺癌Panc-1细胞中HIF-1α的表达。     

慢病毒载体介导的人肝癌HepG2细胞BC047440基因沉默

目的构建BC047440基因RNAi慢病毒干扰载体,并检测其对人肝癌细胞系HepG2细胞中BC047440基因的沉默效果。方法针对已经筛选确定的BC047440基因RNAi有效靶序列,合成BC047440基因特异性shRNA序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-iRNA载体连接产生pFU-GW-shBC047440慢病毒载体,PCR、DNA测序鉴定阳性克隆。用脂质体转染法将pFU-GW-shBC047440、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度,并测定其对人肝癌细胞株HepG2细胞最适感染复数(MOI)。以最适MOI感染HepG2细胞,分BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2组;RT-PCR和Western blot检测各组细胞BC047440 mRNA及蛋白的表达差异。结果经PCR鉴定,成功构建BC047440基因RNAi慢病毒载体。测定慢病毒滴度为5×108TU/ml,其在HepG2细胞中最适MOI为20;RT-PCR和Wes...     

靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF 1α基因过度表达的干扰作用奠定基础。方法根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度。采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒。结果酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml。结论本实验成功构建了针对大鼠HIF-1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1α靶向治疗提供了良好的实验基础。     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

慢病毒载体介导shRNA的研究进展

RNA干扰（RNAi）通过双链RNA的介导,特异性阻止相关序列的表达,从而导致转录后水平的基因沉默.RNAi广泛存在于真核生物中.慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,广泛应用于相关的RNAi研究领域,如抗病毒研究、癌症及其治疗、基因治疗.现已发现,慢病毒载体能够介导组织、时间特异的RNAi,在疾病的基因靶向治疗上必有广阔前景.     

慢病毒介导的HIF-1α mODD在肿瘤细胞中的高表达

目的在肿瘤细胞中利用重组慢病毒介导缺氧诱导因子-1α突变体(HIF-1α mODD)在正常氧压下高表达,以模拟肿瘤缺氧微环境下肿瘤细胞中HIF-1α的高表达,为研究HIF-1介导的缺氧信号通路及其在肿瘤细胞中的作用提供实验模型。方法将含HIF-1αmODD基因片段的慢病毒表达质粒pWPI GW/HIF-1α mODD,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装制备重组慢病毒,重组病毒经过纯化后直接感染GLC、H157和YTMLC等肿瘤细胞,并在正常氧压条件下培养,通过RT-PCR、免疫印迹等方法检测HIF-1α mODD在细胞中的表达水平。结果重组慢病毒介导HIF-1α mODD在GLC、H157和YTMLC细胞内获得高表达。结论成功模拟了肿瘤细胞在缺氧微环境下高表达HIF-1α的情况,为体外研究HIF-1α在肿瘤血管新生及肿瘤生长中的作用提供途径。     

西罗莫司对肝癌HepG2细胞中HIF-1α表达影响

目的 研究西罗莫司对氯化钴(CoCl2)诱导的肝癌Hep2细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响.方法 用CoCl2诱导细胞模拟缺氧微环境,并根据CoCl2浓度不同分为0、50、100、200及00 μmol/L组;选择CoCl2浓度为200 μmol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境,同时分别联合0、10、20、30、0 nmol/L的西罗莫司作用于细胞2 h.应用逆转录-聚合酶链反应检测HIF-1α mRNA的表达.结果 随CoCl2浓度提高,HIF-1α mRNA的表达升高(F=103.67,q=.83～2.15,P<0.05),其中CoCl2浓度为200和00 μmol/L两组比较差异无显著性(q=0.69,P>0.05);西罗莫司可使Hep2细胞HIF-1α mRNA的表达降低并呈剂量依赖性(F=127.90,q=.2～28.28,P<0.05).结论 缺氧微环境可以促进Hep2细胞中HIF-1α mRNA的表达,HIF-1α可能通过在细胞缺氧调控中起作用而参与了肿瘤的发生发展.西罗莫司可以抑制HIF-1α mRNA的表达,这可能是其抗肿瘤的机制之一.     

慢病毒载体介导的 RNA干扰对 HDAC2基因表达的影响

目的：构建组蛋白去乙酰化酶2（ HDAC2）基因的慢病毒表达载体,研究HDAC2基因在肝癌HepG2细胞中的表达。方法：将前期构建并鉴定正确的3条重组表达质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组、2组、3组及1条阴性对照pLKO.1-HDAC2-shRNAneg和空载体对照pLKO.1,运用脂质体法分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2. G共同转染人胚肾细胞293T,制备具有感染能力慢病毒颗粒;收集、纯化含病毒颗粒的上清液并感染人肝癌HepG2细胞,设未处理HepG2细胞为空白对照,采用Real time PCR 和Western blotting检测感染48 h和72 h后HepG2细胞中HDAC2基因mRNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。结果：与空白对照组相比,3条干扰序列转染肝癌HepG2细胞后均能明显抑制HDAC2 mRNA的表达（ P＜0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组的抑制率更明显,达到82.09％;3条干扰序列均能明显抑制HDAC2蛋白的表达（ P＜0.05）,以pLKO.1-HDAC2-shRNA 1组和3组的干扰效果最明显,但两者相比较差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：构建的重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA能从转录水平和蛋白水平有效抑制HDAC2基因在HepG2细胞中表达。     

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

目的：探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响。方法：体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞24 h,同时设无义对照组（转染无义对照siRNA）、空白对照组（转染空脂质体）及正常对照组（不转染）。采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化。结果：mTOR siRNA转染组HepG2细胞mTOR蛋白的表达低于各对照组（P〈0.05）;HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组（P〈0.05）。结论：mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达,且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。     

低氧诱导因子-1α对毛囊细胞的作用

目的探讨外源性人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在成纤维细胞中表达的可行性及其对毛囊周围细胞活性的影响。方法通过脂质体将含有HIF-1αcDNA的真核表达载体pcDNA3.0稳定转染成纤维细胞,应用RT-PCR及Westernblot方法检测HIF-1α在成纤维细胞中的表达,ELISA法检测转染细胞上清液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,RT-PCR方法检测转染后细胞中成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。将该上清加入成纤维细胞及真皮鞘细胞中,MTT法检测加入上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。结果RT-PCR及Westernblot可检测出转染后细胞中HIF-1α的表达,MTT检测加入转染上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性增强（P〈0.05）,并且该上清液VEGF的表达显著高于未转染组（P〈0.01）。转染后成纤维细胞的bFGF的mRNA表达显著高于未转染组（P〈0.01）。结论应用脂质体能够成功地将外源性人HIF-1α基因转染成纤维细胞,并进行有效表达,其表达的HIF-1α可增强细胞活性且可诱导转染细胞上清液中VEGF的表达,并增加bFGF的mRNA表达,且转染细胞上清可增强成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。推测HIF-1α通过其下游因子VEGF及bFGF促进毛囊相关细胞的活性,为HIF-1α对毛囊作用的进一步研究打下了基础。     

HIF—la asODN转染的树突状细胞对胶质瘤细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1a（HIF-1a）反义寡核苷酸（asODN）转染的树突状细胞（DC）与U251胶质瘤细胞融合后的抗胶质瘤活性。方法将HIF-1a asODN利用脂质体包裹转染DC,采用PEG化学融合方法将DC与U251胶质瘤细胞融合,通过MTT法及流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率。结果HIF-1a asODN转染DC组与各对照组相比细胞增殖下降,凋亡增加（P〈0．01）。结论HIF-1a asODN转染DC后,再与U251胶质瘤细胞融合能够比单纯使用HIF-1a asODN转染U251细胞或单纯使用DC细胞取得更好的抑制胶质瘤细胞生长及促进其凋亡的效果。     

PPM1D silencing by lentiviral-mediated RNA interference inhibits proliferation and invasion of human glioma cells

To construct a lentiviral shRNA vector targeting human protein phosphatase 1D magnesium-dependent(PPM1D) gene and detect its effectiveness of gene silencing in human gliomas,specific siRNA targets with short hairpin frame were designed and synthesized.DNA oligo was cloned into the pFU-GW-iRNA lentiviral expression vector,and then PCR and sequencing analyses were conducted to verify the constructs.After the verified plasmids were transfected into 293T cells,the lentivirus was produced and the titer of virus was determined.Real-time quantitative PCR and Western blot were performed to detect the PPM1D expression level in the infected glioma cells.PCR and Western blot analyses revealed the optimal interfering target,and the virus with a titer of 6×108 TU/mL was successfully packaged.The PPM1D expression in human glioma cells was knocked down at both mRNA and protein levels by virus infection.The expression of PPM1D mRNA and protein was decreased by 76.3% and 87.0% respectively as compared with control group.The multiple functions of human glioma cells after PPM1D RNA interference were detected by flow cytometry and cell counting kit-8(CCK-8).Efficient down-regulation of PPM1D resulted in significantly increased cell apoptosis and reduced cell proliferation and invasion potential in U87-MG cells.We have successfully constructed the lentiviral shRNA expression vector capable of stable PPM1D gene silencing at both mRNA and protein levels in glioma cells.And our data gave evidence that the reduced cell growth observed after PPM1D silencing in glioma cells was at least partly due to increased apoptotic cell death.     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞增殖与凋亡的影响.方法:体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞,同时设无义对照组(转染无义siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用MTT法检测...     

低氧环境下三氧化二砷对人肺癌细胞增殖和凋亡的作用

目的：观察常氧和低氧环境下不同浓度的三氧化二砷（arsenic trioxide．As2O3）对人肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。 方法：在常氧（21％O2）和低氧（5％O2）环境下对人肺腺癌细胞A5-19进行体外培养，采用0、1、2、4μmol/L As2O3分别作用A549细胞12、24和48h，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测A519细胞增殖抑制率；膜连蛋白V（Annexin V）／碘化丙啶（propidium iodide．PI）双标记法检测细胞凋亡。 结果：常氧和低氯环境下．1、2、4μmol／L As2O3均能显著抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡，且会随As2O3浓度的升高和作用时间的延长而增强；该作用在两种环境下的差异无统计学意义。结论：As2O3可抑制A549细胞增殖和促进细胞凋亡；在低氧环境和常氧环境下对A549细胞具有同样的细胞毒性作用。     

低氧状态下红景天通过上调缺氧诱导因子1α促进人脐静脉内皮细胞肾上腺髓质素及其受体的表达

 目的  探讨低氧状态下红景天对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)、降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor,CRLR) 、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)表达的影响以及这一过程中HIF-1α的调控作用。方法HUVECs常规培养并设立正常氧、低氧对照组和低氧红景天组。CCK8法观察低氧状态不同浓度红景天干预不同时间的促细胞增殖作用;实时定量PCR和Western blot法测定ADM、CRLR、HIF-1α基因表达的情况;通过小干扰RNA方法敲低HIF-1α基因,实时定量PCR和Western blot法检测ADM、CRLR基因表达的变化。结果 红景天促进低氧状态下HUVECs增殖,促进低氧状态下内皮细胞ADM、CRLR以及HIF-1α的表达,HIF-1α siRNA可以显著抑制红景天对ADM及CRLR表达的促进作用。结论 低氧状态下红景天通过上调HIF-1α促进HUVECs ADM及其受体CRLR的表达。     

低氧诱导因子-1α在骨形成过程中对成骨细胞功能的调控

目的探讨低氧诱导因子（HIF）-1α对成骨细胞功能的调控及其在骨形成过程中的作用。方法应用Cre-Loxp重组酶技术,在体内外条件性敲除成骨细胞中的HIF-1α基因及其上游调控VHL基因,在体外将成骨细胞在2％氧浓度培养48h后检测血管内皮生长因子（VEGF）、核结合因子a1（RunX2）、碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OC）的表达,在体内取3个月龄小鼠股骨远端骨组织,应用组织切片和Micro-CT方法检测骨组织形态计量学指标和骨矿密度（BMD）。结果体外条件性敲除成骨细胞中的HIF-1α基因后,由于HIF-1α的表达下降导致VEGF、RunX2、ALP、OC的表达水平降低,而敲除VHL基因后由于HIF-1α的表达上调导致上述基因的表达升高。体内条件性敲除HIF-1α基因小鼠骨组织形态计量学指标和BMD均劣于野生型小鼠,而体内条件性敲除VHL基因小鼠以上指标均优于野生型小鼠。结论在生理和病理条件下,由于低氧环境的存在,HIF-1α能够通过促进成骨细胞的功能而调控骨形成过程。     

山竹果皮提取物对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响

目的 探讨山竹提取物对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响及其作用机制.方法 采用MTT法检测不同浓度山竹提取物对HepG2细胞增殖的影响;分别应用Annexin-V/PI双重染色、PI单染法检测山竹提取物对HepG2凋亡和细胞周期的影响;天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒检测山竹提取物对HepG2细胞Caspase-3酶活化的影响.结果 不同浓度(100 μmol/L、200μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)山竹提取物均可抑制人肝癌细胞HepG2的增殖活性,且随着山竹提取物浓度及其作用时间的增加,细胞抑制率升高(P＜0.05);山竹提取物浓度为256.67 μmol/L时可诱导人肝癌细胞HepG2出现早期凋亡,并且随着山竹提取物作用时间的增加,凋亡早期癌细胞的比率增高.细胞周期分析结果显示随着山竹提取物的浓度升高(0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L),G1期HepG2细胞比例升高,而S期细胞比例下降(P＜0.05).与对照组(0 μmol/L)比较,各浓度(200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L)山竹提取物组HepG2细胞的Caspase-3酶活性均升高(P＜0.05),给药组的酶活力单位随给药浓度的增加而明显增加(P＜0.05).结论 山竹提取物对人肝癌细胞HepG2有抑制增殖和促进凋亡的作用,其作用机制可能与抑制HepG2细胞进入S期和激活Caspase-3有关.