靶向MMP-9脱氧核酶抑制人肺腺癌细胞的粘附与迁移的实验研究

背景与目的脱氧核酶(DNAzyme,Deoxyribozyme)具有高效的催化活性和特异的序列识别能力,可特异性切割靶RNA使其失去生物学活性,从而抑制靶RNA的基因表达。本实验通过探讨靶向MMP-9的脱氧核酶对人肺腺癌A549细胞的细胞粘附与迁移能力的影响,为使用脱氧核酶抑制肺癌的浸润转移提供理论依据。方法设计靶向MMP-9的脱氧核酶,应用oligofectamine将脱氧核酶转染到A549细胞中,采用Western blot方法检测细胞中MMP-9的表达,以及利用细胞粘附与迁移试验观察脱氧核酶干预后细胞粘附与迁移能力的变化。结果在靶向MMP-9脱氧核酶干预后,细胞中MMP-9的表达较对照组与空白组显著减低(P<0.01),同时发现细胞的粘附率、迁移速度均显著降低(P<0.01)。结论靶向MMP-9的脱氧核酶能够抑制人肺腺癌A549细胞中MMP-9的表达,并且有效阻止细胞的粘附与迁移。     

VEGF特异性核酶对Hela细胞VEGF表达的调节

目的：构建VEGF特异性发夹状核酶基因真核表达载体，观察其对Lela细胞VEGF表达的调节。方法：将核酶基因克隆入pcDNA3中，构建了抗VEGF发夹状核酶真核表达载体pcDNA3-RZ,并进行了核酶的体外切割活性检测。将真核表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，采用RNA斑点杂交、流式细胞仪免疫荧光及免疫细胞化学方法，检测Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平。结果：所构建的重组表达载体pcDNA3-RZ正确，体外切割检测该核酶具有较高的切割活性。转染了pcDNA-RZ的Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平明显下降。结论：成功地构建了抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体，该载体能明显抑制Hela细胞VEGF的表达。     

瘦素对人肺腺癌A549细胞增殖及p-ERK1/2、VEGF表达的影响

 目的观察瘦素对人肺腺癌 A549 细胞增殖及p-ERK1/2、VEGF 表达的影响。初步探讨瘦素在促进肿瘤血管生成中的机制。方法 对人肺腺癌 A549 细胞采用细胞培养,MTT 法检测不同浓度瘦素对人肺腺癌A549细胞增殖影响,免疫组织化学法检测VEGF表达、Western blot 方法检测瘦素对p-ERK1/2、VEGF表达的影响。结果 在一定范围内,瘦素呈时间、剂量依赖性促进A549细胞的生长(P<0.05);与阴性对照组相比,不同浓度瘦素作用48h 后p-ERK1/2、VEGF 蛋白表达明显增加并具有剂量依赖性(P<0.05);p-ERK1/2和VEGF 之间呈正相关性(r=0.694,P<0.05)。结论 在体外瘦素对人肺腺癌A549 细胞有明显增殖作用,通过促进p ERK1/2和VEGF的表达,瘦素在促进肺癌血管的生长机制中可能具有一定作用。     

大黄素对人肺腺癌A549细胞体外增殖凋亡及VEGF和TNF-α分泌的影响

目的为大黄素抗肺腺癌的临床应用提供理论依据。方法MTT实验检测大黄素不同浓度梯度（5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L,80μmol/L）和时间梯度（12,24,48和72 h）处理后A549细胞的增殖活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Hoechst 33258染色法检测大黄素作用A549细胞后引起的细胞凋亡程度;应用酶联免疫吸附分析（ELISA）实验检测大黄素各处理组培养上清液中所含的VEGF、TNF-α的浓度。结果大黄素体外可浓度和时间依赖性地抑制人肺腺癌A549细胞的增殖活力及促进细胞凋亡,抑制A549细胞VEGF的表达和分泌,促进TNF-α的表达和分泌。结论大黄素具有抗增殖、促凋亡、抗血管生成等多种潜能,具有良好的抗人非小细胞肺癌特别是肺腺癌的临床应用前景。     

VEGF促进肺癌细胞侵袭性的自分泌机制初探

目的 通过研究VEGF、MMP-9之间的关系,初步探讨VEGF促进肺癌细胞侵袭性的自分泌机制,以期为肿瘤的抗VEGF治疗提供一定的理论依据.方法 在体外用条件培养基培养人肺腺癌细胞A549,经细胞免疫化学染色、侵袭实验方法来测定VEGF对肺腺癌细胞A549的MMP-9表达及侵袭性的影响.结果 (1)各实验组的A549细胞在不同浓度的rh VEGF165和不同时间的作用下,细胞内的MMP-9的表达有差异;(2)A549细胞侵袭数在和照组间差异有显著性(P＜0.001).结论 (1)VEGF能上调A549细胞内的MMP-9表达,且促进作用具有时间-剂量依赖性;(2)VEGF能促进A549细胞的侵袭性;(3)肺癌细胞中存在有自分泌机制,VEGF可通过自分泌机制上调肺癌细胞的MMP-9表达,进而促进肿瘤的浸润转移.     

表达抗-VEGF发夹状核酶腺病毒载体的构建及其对结肠癌生长的抑制作用

背景与目的：VEGF过表达提示结肠癌预后不良。本实验构建带有抗-VEGF发夹状核酶的复制缺陷型腺病毒，观察其对结肠癌VEGF表达及肿瘤生长的抑制作用。方法：将人工合成的抗-VEGF发夹状核酶DNA定向克隆至转移质粒pAdTrack—CMV多克隆位点，然后与病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中重组，在293a细胞中包装成完整病毒（命名为Ad-Rz）并复制扩增、纯化。RT-PCR检测病毒感染后抗-VEGF发夹状核酶在HT-29细胞中的表达、real-time PCR及ELISA检测其对VEGF mRNA及蛋白表达的抑制作用。观察Ad-Rz对HT-29细胞和裸鼠移植瘤生长的抑制作用，CD34标记检测肿瘤组织微血管密度（MVD）。结果：抗-VEGF发夹状核酶成功克隆至复制缺陷型腺病毒载体上。抗-VEGF发夹状核酶可在HT-29细胞中表达．Ad—Rz感染的HT-29细胞中VEGFmRNA的相对表达量大约为PBS组的45％（e〈0．05）。ELISA结果显示Ad—Rz感染后的细胞上清液中蛋白含量（A值）为0．455±0．35／百万细胞，低于PBS组（P〈0．05）。Ad—Rz对HT-29细胞的生长抑制无统计学意义（P〉0．05），但可显著抑制肿瘤组织内血管的形成（P〈0．05），Ad—Rz治疗的移植瘤增殖率低于PBS组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：腺病毒载体介导的抗-VEGF发夹状核酶可有效抑制HT-29细胞VEGF的表达及移植瘤组织内血管的生成。     

端粒酶催化亚基脱氧核酶抑制A549/DDP耐药细胞生长的实验研究

背景与目的 端粒酶在多种肿瘤中均有表达，并且可能参与肿瘤耐药。本研究的目的是观察端粒酶催化亚基脱氧核酶对A549／DDP耐药细胞生长的抑制作用，探讨端粒酶作为耐药肿瘤细胞治疗新靶标的可能性。方法 合成针对端粒酶催化亚基mRNA的脱氧核酶，脱氧核酶体外切割端粒酶催化亚基mRNA片段。采用TRAP法检测转染脱氧核酶的A549／DDP细胞端粒酶活性，采用MTT法分别检测脂质体转染脱氧核酶、顺铂及其混合物对A549／DDP细胞生长的作用。结果 端粒酶脱氧核酶在体外可以切割端粒酶催化亚基RNA，并具有剂量依赖关系；转染脱氧核酶可抑制A549／DDP细胞端粒酶活性；端粒酶脱氧核酶0．25umol／L作用72h，A549／DDP耐药细胞生长抑制率可达32．9％，同3mg／L顺铂联合使用时抑制率可达60．5％，两者相互作用指数CDI=0、9。结论 端粒酶催化亚基脱氧核酶可明显降低端粒酶活性，显著抑制人肺腺癌A549／DDP耐药细胞的生长，并且与化疗药物顺铂有协同作用，提示端粒酶有可能成为耐药肿瘤细胞新的治疗靶标。     

促红细胞生成素对肺腺癌A549细胞生长和凋亡作用的实验研究

背景与目的 促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对肿瘤细胞的具体作用存在争议.本研究旨在探讨细胞因子超家族成员EPO对肺腺癌AS49细胞株生物学行为的影响.方法 构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-hEPO,并转染肺腺癌A549细胞株.采用酶联免疫吸附(ELISA)法检洲转染后目的基因的蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测转染后A549细胞生长、周期及凋亡率等生物学行为的变化;ELISA法检测转染后细胞VEGF表达水平的变化.结果 成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-hEPO;转染后各检测时间点,EPO转染组细胞生长均明显受抑(P<0.01);流式细胞术分析表明,EPO转染组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05).且凋亡率也明显增高(P<0.01);EPO转染组VEGF表达量明显降低(P<0.01).结论 EPO基因转染A549后有抑制细胞生长、促进凋亡的作用,并且还可抑制细胞表达VEGF.     

高表达p73 基因对肺腺癌细胞VEGF 、bFGF 表达抑制作用的研究

 目的 观察高表达的p73基因对肺腺癌细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平的影响。方法 将p73基因以脂质体法转染A549细胞、H1299细胞，G418筛选阳性细胞克隆．采用RT-PCR半定量法检测转染前后VEGF、bFGF mRNA的表达水平，Western-blot半定量法检测蛋白表达水平。结果 转染p73基因后，A549细胞、H1299细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平均下降，较未转染p73基因的细胞有显著性差异(P<0．05)。结论 高表达的p73基因能够降低肺腺癌细胞中VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达水平，提示p73基因可能抑制人类肺腺癌的血管生成。     

Sp1 inhibition-mediated upregulation of VEGF165b induced by rh-endostatin enhances antiangiogenic and anticancer effect of rh-endostatin in A549

Recombinant human endostatin (rh-endostatin), a potential antiangiogenic agent, is used in non-small cell lung carcinoma treatment and represses vascular endothelial cell growth factor (VEGF) levels in tumor cell. However, precise affection of rh-endostatin on the proangiogenic VEGF isoforms (VEGF₁₆₅) or antiangiogenic VEGF isoforms (VEGF₁₆₅b) is not clear. We therefore tested the hypothesis that rh-endostatin could alter expression of these isoforms to regulate tumor growth. A549 cells were exposed to rh-endostatin, and the expression of VEGF₁₆₅ and VEGF₁₆₅b was detected. The role of SP1 as a regulator of isoform expression was investigated. We then examined the anticancer and antiangiogenic efficacy of rh-endostatin in combination with exogenous VEGF₁₆₅b against A549 cells, EA.HY 926 cells and xenograft model of human lung cancer. rh-Endostatin reduced VEGF₁₆₅ and induced VEGF₁₆₅b as well as inhibited SP1 in A549 cells. SP1 inhibitor (betulinic acid) also developed those changes. VEGF₁₆₅b–rh-endostatin combination was highly synergistic and inhibited growth, survival, and migration of A549 cells, VEGF-mediated VEGFR2 phosphorylation in EA.HY 926 cells, and tumor growth in xenograft model of human lung cancer. rh-Endostatin downregulates proangiogenic vascular endothelial growth factor A (VEGFA) isoform and upregulates antiangiogenic VEGFA isoform, possibly through inhibition of SP1. Furthermore, VEGF₁₆₅b sensitizes A549 to rh-endostatin treatment and enhances the anticancer effect of rh-endostatin.     

外源性p27kipl对肺癌细胞系A549的影响

目的：研究外源性p27基因对肺癌细胞系A549的影响。方法，将p27基因重组入腺病毒表达载体pAdCMV中，得到重组腺病毒，感染人肺癌细胞系A549，用激光共聚焦，打点杂交方法检测p27基因在细胞感染前后的表达情况，应用MTT、流式细胞术、细胞软琼脂克隆形成等方法研究p27基因对A549细胞周期，形态、生长等特性的影响。结果：转染p27基因的A549细胞内确有外源性p27基因的表达，p27蛋白表达量明显提高，转染p27基因可使549细胞发生凋亡并发生G1期阻滞。结论：p27基因可诱导肺癌细胞出现凋亡及周期阻滞，为肺癌的基因治疗提供了一个新的思路。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

榄香烯乳对人肺腺癌 A549 细胞株凋亡蛋白表达的影响

目的:探讨榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株凋亡蛋白表达的影响.方法:体外培养人肺腺癌A549细胞株,四甲基偶氮唑蓝比色试验法(MTT法)测定不同浓度榄香烯乳在不同作用时间下对A549细胞株的生长抑制作用.IC软件计算10％的细胞抑制浓度(IC10).免疫细胞化学染色观察榄香烯乳作用24h后A549细胞的Bcl-2、Bax、Survivin及VEGF蛋白的表达变化.结果:榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株增殖具有明显抑制作用,呈时间和剂量依赖性.榄香烯乳作用24h后IC10为43.49μg/ml,Bax蛋白表达增加,细胞质着色增强;Bcl-2蛋白表达下降,细胞质着色减弱;增殖蛋白Survivin和VEGF的表达下降,且具有药物浓度相关性.结论:榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞株有明显的抑制作用,榄香烯乳可上调凋亡相关蛋白表达、诱导凋亡.     

survivin shRNA重组腺病毒的构建及其对人肺癌细胞A549的作用

 目的 构建携带人生存素survivin短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体的重组腺病毒,以此介导小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）药物对人A549细胞肺癌的治疗,为下一步动物实验研究提供基础。 方法 将前期实验中构建并筛选的重组质粒pShutte-survivin与携带LacZ标签的腺病毒骨架质粒共转染HEK-293 T细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-survivin;经PCR鉴定并测定病毒滴度;β-gal染色检测病毒对人肺癌细胞A549的感染效率;MTT实验和流式细胞术检测其对A549细胞的作用;半定量RT-PCR检测RNAi效果;Hoechst染色观察凋亡情况。 结果 PCR证实重组腺病毒Ad-survivin构建成功;β-gal染色表明感染效率明显;A549细胞增殖受到抑制并阻滞于G₂/M期;survivin mRNA的表达受到抑制;荧光染色发现有凋亡细胞。 结论 成功构建人survivin基因shRNA 表达载体的重组腺病毒,下调survivin表达后能诱导A549 细胞凋亡,为研究肺癌RNAi 途径的基因治疗奠定基础。     

Ribozyme approach to downregulate vascular endothelial growth factor (VEGF) 189 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC)

The aim of this study was to further clarify the role of the cell-associated isoform of vascular endothelial growth factor (VEGF189) on tumour growth and vascularity. Five isoforms of VEGF have been identified with different biological activities. VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206 are generated by alternative splicing. We used a hammerhead-type ribozyme (V189Rz) to suppress VEGF189 mRNA. The V189Rz specifically cleaved exon 6 of VEGF189 mRNA, but showed no activity against the VEGF121 or VEGF165 isoforms. The V189Rz was introduced into the human non-small cell lung cancer (NSCLC) cell line (OZ-6/VR). The expression level of VEGF189 mRNA was decreased in the OZ-6/VR cells, while VEGF121 and 165 expression was unaltered. The OZ-6/VR cells xenotransplanted into nude mice showed markedly reduced vascularisation and growth, whereas the cell line did not show any decreased growth under tissue culture conditions. The OZ-6/VR cells (1×10⁵ cells/mouse) formed no tumours, whereas the parental OZ-6 cells formed large tumours within 8 weeks. The specific suppression of VEGF189 by the ribozyme decreased vascularity and xenotransplantability of the lung cancer cell line. Thus, the cell-associated isoform of VEGF, VEGF189, might have a key role in stromal vascularisation and the growth of NSCLC xenografts in vivo.     

Enhanced efficacy of radiation-induced gene therapy in mice bearing lung adenocarcinoma xenografts using hypoxia responsive elements

The aim of the present study was to investigate whether the hypoxia responsive element (HRE) could be used to enhance suicide gene (HSV-tk) expression and tumoricidal activity in radiation-controlled gene therapy of human lung adenocarcinoma xenografts. A chimeric promoter, HRE-Egr, was generated by directly linking a 0.3-kb fragment of HRE to a 0.6-kb human Egr-1 promoter. Retroviral vectors containing luciferase or the HSV-tk gene driven by Egr-1 or HRE-Egr were constructed. A human adenocarcinoma cell line (A549) was stably transfected with the above vectors using the lipofectamine method. The sensitivity of transfected cells to prodrug ganciclovir (GCV) and cell survival rates were analyzed after exposure to a dose of 2 Gy radiation and hypoxia (1%). In vivo, tumor xenografts in BALB/c mice were transfected with the constructed retroviruses and irradiated to a total dose of 6 Gy, followed by GCV treatment (20 mg/kg for 14 days). When the HSV-tk gene controlled by the HRE-Egr promoter was introduced into A549 cells by a retroviral vector, the exposure to 1% O(2) and 2 Gy radiation induced significant enhancement of GCV cytotoxicity to the cells. Moreover, in nude mice bearing solid tumor xenografts, only the tumors infected with the hybrid promoter-containing virus gradually disappeared after GCV administration and radiation. These results indicate that HRE can enhance transgene expression and tumoricidal activity in HSV-tk gene therapy controlled by ionizing radiation in hypoxic human lung adenocarcinoma.