羧甲基壳聚糖钙与骨髓基质细胞生物相容性的初步实验

目的  通过体外小鼠骨髓基质细胞培养,从细胞形态和细胞增殖方面评价新型生物材料羧甲基壳聚糖钙的细胞生物相容性。方法  合成羧甲基壳聚糖钙,进行红外光谱分析,并用DMEM制备浸提液。分别用含羧甲基壳聚糖钙浸提成分的培养液 (实验组)、DMEM 培养液(阴性对照组)和含6.4g／L苯酚培养液 (阳性对照组)培养骨髓基质细胞,通过倒置相差显微镜观察和MTT比色法评价细胞生长及增殖情况。结果  红外光谱分析提示,羧甲基壳聚糖与钙离子发生了络合反应。镜下观察,细胞培养1、2、3d,实验组与阴性对照组细胞数量明显增加,细胞形态正常;阳性对照组细胞数量明显减少,细胞固缩甚至崩解。MTT比色法,实验组与阴性对照组吸光度(A)值间无统计学差异(P>0.05),实验组各时间点的毒性分级为0级;阳性对照组A值明显低于其他组(P<0.01),毒性分级为4级。结论  羧甲基壳聚糖钙复合材料对小鼠骨髓基质细胞有良好细胞生物相容性,是一种可用于组织工程的新型生物材料。     

β-磷酸三钙多孔陶瓷与骨髓间充质干细胞生物相容性的体外实验研究

目的　探讨 β 磷酸三钙 (β tricalciumphosphate ,β TCP)多孔陶瓷与骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmes enchymalstemcells ,BMSCs)的生物相容性 ,为组织工程方法修复骨和软骨缺损提供依据。 方法　将骨髓间充质干细胞与β 磷酸三钙多孔陶瓷复合并体外培养 ,然后进行形态学、细胞增殖、DNA含量、蛋白质含量测定。 结果　骨髓间充质干细胞能够贴附在 β 磷酸三钙多孔陶瓷孔隙内生长 ,其DNA复制和蛋白合成功能不受 β 磷酸三钙的影响。 结论　β 磷酸三钙多孔陶瓷生物相容性良好 ,可作为组织工程的支架材料应用于骨和软骨缺损的修复。     

骨髓基质细胞与聚己内酯生物相容性的实验研究

目的:探讨骨髓基质细胞与聚己内酯 (PCL )的生物相容性 ,为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。方法 :将骨髓基质细胞与 PCL体外复合培养 ,进行形态学观察和细胞增殖、蛋白质含量及酶学测定。结果 :骨髓基质细胞能在 PCL上贴附、繁殖 ,其生长及功能不受影响 ,并且 PCL具有一定的促细胞增殖作用。结论 :PCL具有良好的生物相容性 ,有可能作为骨髓基质细胞的载体而应用于骨组织工程的研究。     

兔骨髓基质细胞与聚DL-乳酸/羟基磷灰石生物相容性的实验研究

目的检测聚DL-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）复合材料的特性,探讨骨髓基质细胞（BMSCs）与PDLLA/HA的生物相容性,为筛选骨组织工程的支架材料提供依据.方法将BMSCs与PDLLA/HA复合体外培养,通过形态学的观察、细胞增殖率及ALP活性的测定,观察PDLLA/HA对培养细胞的影响.结果复合培养时BMSCs能在PDLLA/HA上贴附、繁殖,其生长及功能不受影响.结论 PDLLA/HA具有良好的细胞相容性,能作为骨组织工程种子细胞的支架材料.     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨β-磷酸三钙(β-TCP)的体外相容性．为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备，方法取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组：A组将rBMSC与HA复合培养；B组rBMSC与β-TCP复合培养：C组为对照，只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况．MTT法半定量检测细胞增殖。结果倒置显微镜下见HA组细胞生长良好，与对照组无显著差异。β-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面．有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好，β-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近，而β-TCP组则显著低于对照组。结论新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好，可用作恒河猴骨组织工程的支架材料．AO人工骨需要作性能上的改进。     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的 观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨茁-磷酸三钙(茁-TCP)的体外相容性。为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备。方法 取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组:A组将rBMSC与HA复合培养;B组rBMSC与茁-TCP复合培养;C组为对照,只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖。结果 倒置显微镜下见HA组细胞生长良好,与对照组无显著差异。茁-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面,有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好,茁-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近,而茁-TCP组则显著低于对照组。结论 新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好,可用作恒河猴骨组织工程的支架材料,AO人工骨需要作性能上的改进。     

狗牙周膜细胞与壳聚糖-磷酸三钙三维培养的实验研究

目的：建立狗牙周膜细胞（PDLCs）体外三维立体培养模型,探讨以狗PDLCs为种子细胞,以壳聚糖-磷酸三钙复合体为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。方法：冷冻干燥法制备壳聚糖-磷酸三钙多孔复合支架材料,组织块法培养狗牙周膜细胞,取第4代细胞传代扩增后接种到三维支架上,体外继续培养。免疫组化方法鉴定细胞起源;MTT法检测支架对狗PDLCs增殖的影响;取培养3、6?d的细胞-支架复合物的标本,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的形态及在支架上的粘附、生长情况。结果：免疫组化显示,狗PDLCs抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证实为中胚层来源。MTT法检测结果显示,支架材料对狗PDLCs的生长、增殖与空白对照组相比差异均无统计学意义(P＞0．05)。扫描电镜示壳聚糖-磷酸三钙复合体具有良好的多孔网状结构,狗PDLCs在支架上贴附牢固,伸展充分,增殖旺盛并分泌大量的细胞外基质。结论：壳聚糖-磷酸三钙具有良好的粘附性和细胞相容性,狗PDLCs与之复合培养生长良好,表明以自体PDLCs为种子细胞、以壳聚糖-磷酸三钙为支架材料进行的牙周组织工程是可行的。     

rhBMP2/TGF-β对β-磷酸三钙与骨髓基质细胞自体皮下成骨能力的影响

目的：观察rhBMP₂/TGF-β对β-磷酸三钙与骨髓基质细胞在自体皮下成骨能力的影响。方法：应用矿化条件培养液体外培养成年新西兰兔的骨髓基质细胞,收集细胞并以5×10⁶,·mL^-1浓度分成4组,A组加入rhBMP₂（15 μg）／TGF-β(30 ng) ,B组加入rhBMP₂（15 μg）,C组不加因子作为对照,然后将细胞接种在β-磷酸三钙上,体外培养3 d,D组细胞不接种材料上,继续体外培养。组织化学方法检测碱性磷酸酶。将复合物埋植于新西兰兔自体皮下。5周后常规HE染色、免疫组织化学染色并进行图像分析,观察Ⅰ型胶原、骨形成蛋白合成情况。结果：A、B组的碱性磷酸酶平均A值显著高于C、D组（P<0.01）;复合物植入皮下5周时HE染色见各组均有条索状骨基质形成, A、B组Ⅰ型胶原平均灰度值明显低于C组（P<0.01）,各组免疫组织化学检测及图像分析显示骨形成蛋白的表达差异无显著性（P>0.05）。结论：β-磷酸三钙与骨髓基质细胞在自体皮下能够形成骨组织,rhBMP₂/TGF -β较rhBMP₂有更强的促进骨形成作用。     

羟基磷灰石/磷酸三钙作为细胞载体的体外实验

目的：探讨羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）复合材料作为组织工程载体的可能;为基质材料表面改性提供实验基础。方法：应用人骨髓基质细胞（hBMSCs）和脐静脉内皮细胞(UVECs)和HA/TCP进行混合培养,应用光学显微镜、荧光显微镜及扫描电子显微镜对其进行观察。结果：人骨髓基质细胞和脐静脉内皮细胞在HA/TCP表面均生长良好,并可观察到细胞长入基质材料微孔内的改变。结论：羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）复合材料可作为细胞移植的载体。     

骨髓基质细胞与异种脱蛋白骨生物相容性的体外实验

骨组织工程研究为治疗骨缺损、骨不连开辟了新的途 经［１］。目前,国内外学者多采用成骨细胞、骨膜细胞和骨髓基 质细胞种植于人工合成材料上制备组织工程化骨［２－５］。采用 骨髓基质细胞和天然材料,尤其是脱蛋白骨来制备组织工程化 骨的研究报道甚少［６］。本实验检测骨髓基质细胞与脱蛋白骨 体外生物相溶性,旨在为采用这两者制备组织工程化骨提供依 据。 １　材料和方法 １。１　材料 ＰＲＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ）、加强型小牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、胰蛋白酶 （ＧＩＢＣＯ）、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）、四唑盐（ＭＴＴ,Ｓ…     

Comparative study on seeding methods of human bone marrow stromal cells in bone tissue engineering

Background In general the traditional static seeding method has its limitation while the dynamic seeding method reveals its advantages over traditional static method. We compared static and dynamic seeding method for human bone marrow stromal cells (hBMSCs) in bone tissue engineering.Methods DNA assay was used for detecting the maximal initial seeding concentration for static seeding. Dynamic and static seeding methods were compared, when scaffolds were loaded with hBMSCs at this maximal initial cell seeding concentration. Histology and scanning electron microscope(SEM) were examined to evaluate the distribution of cells inside the constructs. Markers encoding osteogenic genes were measured by fluorescent RT-PCR. The protocol for dynamic seeding of hBMSCs was also investigated.Results DNA assay showed that the static maximal initial seeding concentration was lower than that in dynamic seeding. Histology and SEM showed even distribution and spread of cells in the dynamically seeded constructs, while their statically seeded counterparts showed cell aggregation.Fluorescent RT-PCR again showed stronger osteogenic potential of dynamically seeded constructs.Conclusion dynamic seeding of hBMSCs is a promising technique in bone tissue engineering.     

兔骨髓基质细胞与自体牙骨质片的体外附着生长

目的:探索兔骨髓基质细胞与自体牙骨质片的体外附着生长规律. 方法:体外分离培养新西兰大白兔骨髓基质细胞,接种于牙片联合培养4 wk,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞与材料附着情况. 结果:骨髓基质细胞附着牙骨质片生长良好,贴附紧密,并能形成新生的类牙骨质样矿化组织. 结论:骨髓基质细胞能在牙骨质片上附着生长并形成新生矿化组织,是理想的牙周组织工程种子细胞.     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点。其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞。该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性。方法 将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20％上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照。各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价。结果 各组细胞均与材料粘附良好。8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌。9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织。阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝。低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组。结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20％浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果。     

压应力对组织工程骨内人骨髓基质细胞增殖能力影响的实验研究

目的 探讨压缩应变对组织工程骨内人骨髓基质细胞(human bone mallow stromal cells,hBMSCs)增殖的作用及适合强度范围.方法 双相接种法构建组织工程骨,对其施加频率为0.5 Hz,压缩幅度分别为2%、5%、10%、15%、20%的压应力刺激hBMSCs(2 h/d).倒置显微镜观察细胞形态,扫描电镜观察培育的组织工程骨,常规病理切片和HE染色观察培育组织工程骨内细胞分布及生长情况.MTT法和流式细胞技术检测细胞增殖水平及生长周期.结果 压缩幅度为2%、5%、10%时压应力刺激可促进hBMSCs增殖;压缩幅度为15%、20%时压应力刺激抑制细胞增殖,其中以10%压缩幅度刺激细胞增殖效果最为显著,生长曲线比对照组明显前移,S期细胞百分比(27.45±0.25)%较对照组(19.15±0.26)%增高43.34%.结论 适当强度的压应力可促进hBMSCs的增殖,5%～10%的压缩幅度是促进hBMSCs增殖的适合强度.     

骨髓基质细胞与玻璃陶瓷复合培养体内成骨的实验研究

目的 观察骨髓基质细胞（BMSC）与钙磷陶瓷（BGC）复合后形成骨组织的生物学机制,为形成组织工程化新生骨组织提供理论依据。方法 将BMSC与BGC复合植入动物体内后进行大体观察、组织学染色,观察其成骨过程。结果 一定浓度的BMSC与BGC复合植入动物体内可产生成熟新生骨组织,其成骨过程与局部血运、材料孔隙、孔径有关。结论 利用组织工程学方法可以形成新生骨组织,为进一步研究组织工程化新生组织的体内移植手段和方法提供了新的思路和可能。     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。