幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

2型猪链球菌组氨酸三聚体蛋白家族05SSU1267的克隆、表达及免疫保护作用研究

目的对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)05ZYH33组氨酸三聚体蛋白家族(Histidine triadprotein,Htp)成员编码基因05SSU1267进行克隆、表达,并研究其免疫保护作用。方法根据05ZYH33基因组编码的05SSU1267基因序列设计引物,PCR扩增目的片段。将目的基因克隆入原核表达载体pET32a,并转化E.coli BL21(DE3)。通过IPTG诱导表达、His-Tag亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并将纯化后的蛋白用于Western blot分析。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备兔多抗血清,并通过ELISA检测多抗血清的效价。重组蛋白免疫Balb/c小鼠,研究其免疫保护作用。结果 Western blot显示重组蛋白可以与兔抗05ZYH33全菌血清反应,显示该蛋白具有较好的免疫反应原性;ELISA结果显示重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清;动物保护实验表明该蛋白具有一定的免疫保护作用。结论在原核系统成功表达了05ZYH33 Htp蛋白05SSU1267,动物实验结果表明其能够在Balb/c小鼠中发挥一定的免疫保护作用,研究结果为Htp蛋白作为2型猪链球菌疫苗候选分子以及进一步了解该蛋白家族的生物学功能奠定基础。     

HAV 3a与3d融合蛋白在原核系统中的表达及其抗原活性的研究

目的 研究HAV 3a(位于1403-1456aa)与3d(位于1719-1764aa)融合蛋白在原核系统中的表达，并探讨该重组蛋白的抗原活性及其应用价值。方法 采用常规PCR方法，从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAVl6H1上扩增出目的基因，以pET—30a作为表达载体，构建重组表达质粒pET—3ad。该重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用镍金属柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组质粒pET—3ad经双酶切(Nco I／Hind Ⅲ)鉴定和序列测定证实构建成功。在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达有一相对分子质量为18000的重组蛋白P3ad，该蛋白经亲和层析获得了良好的纯化效果。Western blot结果显示在相对分子质量为18000处有一特异的免疫印迹条带，表明重组蛋白P3ad具有特异的抗原活性；间接ELISA方法进一步证实了该蛋白的抗原性。结论 采用常规的克隆操作方法构建了重组表达质粒pET—3ad，其表达量为20％。表达产物具有良好的抗原性，有望应用于急性HAV感染的诊断和区分活病毒的感染及灭活疫苗的免疫。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定北大核心CSCD

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

ctB和ureⅠ双基因融合表达及其免疫特性分析

目的：构建霍乱毒素B亚单位（CtB）和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（UreⅠ）融合的原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,并初步研究融合蛋白Ct B/Ure Ⅰ的表达特性和免疫特性.方法：PCR从pUC18 ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a（＋）/ureⅠ的ureⅠ基因5＇端插入ctB基因,构建ctB和ure Ⅰ双基因原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,转该质粒于E.coli BL-21（DE3）,经酶切和序列分析鉴定工程菌.IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-Pro Analizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠.用Western blot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性.结果：工程菌含完整的ctB和ure Ⅰ基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%.在22℃,1 mmol/L IPTG诱导4 h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%.Western blot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体.结论：成功构建了能表达CtB/Ure Ⅰ蛋白的大肠杆菌表达菌株.对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和Ure Ⅰ的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础.     

幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答

目的　构建H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株 ,并进行初步的免疫原性分析。方法　将H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A asd质粒的多克隆位点之内。挑取单菌落质粒鉴定后 ,分别将其电击经中间宿主X3730转入最终宿主X4 0 72 ,SDS PAGE和Westernblot检测蛋白表达。将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB c小鼠。结果　疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量 (Mr)为 6 4× 10 3的UreB蛋白及 77× 10 3的UreB HspA融合蛋白。在免疫BALB c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H .pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体。结论　构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株 ,为探索制备H .pylori口服活菌疫苗奠定了基础。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达，表达产物进行SDS—PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白；用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清，Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上，抗His的抗体Western-blot分析，发现特异性区带出现在63000u处，证明该蛋白是所要表达的融合蛋白，制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC，且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

人促血液血管细胞生成素的原核表达及兔抗体的制备

目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAPO免疫新西兰大白兔,制备抗体并测定其效价。结果:获得高效表达并纯化的HAPO蛋白。制备的兔抗人HAPO抗体的免疫双扩散的效价为1∶8。结论:建立了HAPO基因的原核表达载体和快速纯化体系并制备出兔抗HAPO的抗体,为研制检测HAPO的ELISA试剂盒奠定了基础。     

五日热巴通体重组外膜蛋白HbpA的研制和抗原性分析

为克隆并表达五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因,并对其抗原性进行初步分析,采用PCR方法从五日热巴通体基因组DNA扩增hbpA基因,将目的基因片段插入原核表达质粒pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hbpA;将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹实验分析表达的目的蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现pET32a（＋）-hbpA转化菌高效表达一48kDa重组蛋白;免疫印迹分析发现该蛋白与其免疫血清发生强烈反应;间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别五日热巴通体。实验结果表明五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因已在大肠杆菌中高效表达。     

Stx1-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定

目的构建志贺毒素1-A亚单位(Stx1-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值。方法以大肠埃希菌O157DNA为模板扩增Stx1-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。重组蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stx1-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带。结论成功构建了pET32a( )/Stx1-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stx1-A蛋白,为进一步制备抗Stx1-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础。     

异种表皮生长因子受体胞外段的表达及其抗肿瘤效果研究

目的:构建异种EGFR蛋白疫苗并研究其抗肿瘤效果.方法:用PCR方法获得鸡EGFR胞外片段, 与pGEX- 4T-2载体连接, 并在E.coli BL21(DE3)中表达鸡的EGFR胞外片段与GST的融合蛋白, 融合蛋白经Ni2 亲和层析柱纯化、复性后, 免疫小鼠, 免疫3次后, 接种小鼠Lewis细胞, 观测肿瘤生长情况, ELISA检测小鼠血清中抗EGFR蛋白的抗体效价.结果:成功构建了EGFR胞外段基因的原核表达载体; SDS-PAGE显示成功表达了目的融合蛋白; 融合蛋白免疫小鼠后, ELISA法检测到特异性抗EGFR抗体; 实验组与对照组肿瘤体积的比较结果显示, 融合蛋白疫苗能够在一定程度上抑制肿瘤的生长.结论:异种EGFR蛋白能够克服免疫耐受问题, 诱导机体产生抗体, 有一定的抗肿瘤效果, 为后续的肿瘤疫苗研究打下了基础.