结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因构建真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6，并鉴定其在真核细胞(COS-7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误后，再将PCR反应产物克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。并用脂质体介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6转染真核细胞COS-7，72h后，通过SDS—PAGE和免疫印迹鉴定ESAT-6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT-6构建重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ESAT-成功，通过SDS—PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量6kDa的特异蛋白，免疫印迹证明该6kDa蛋白能与抗ESAT-6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6真核表达重组质粒成功构建，该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,并构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-ESAT-6和重组耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,克隆入pGEMT载体。然后,构建亚克隆ps3000-ESAT-6大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将ESAT-6基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacteri-umsmegmatis mc~2155)中,热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察ESAT-6蛋白的表达,Western blotting鉴定其生物学活性。结果成功扩增了结核杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。结论ESAT-6重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG(BacilliCalmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究

目的构建结核分枝杆菌（MTB）重组质粒pGEX-ESAT-6，分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因的高效原核表达载体pGEX-1λT，经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6／GST融合蛋白；SDS—PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因；双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中，构建了pGEX—ESAT-6穿梭表达载体。SDS—PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku，表达效率为20％，Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达，表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白.以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定. 结果 结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上.重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5 μg/ml 重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml) 等效.结论 重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化

目的克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction,PCR）扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性。结果 PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库（Genbank）报道的完全一致。三者在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合。Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白。ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原。     

结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗的构建、鉴定和表达及其保护力

目的构建和鉴定结核分枝杆菌(MTB)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-ESAT-6疫苗,研究该疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-ESAT-6;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗。用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达ES-AT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。65只BALB/c雌性小鼠,随机分为5组:A组(SC)、B组(IM)、C组(IN)、D组(Bb)、E组(PBS)。分别于免疫后8周用5×105CFU MTB H37Ra减毒株悬浮于10μL PBS中进行鼻腔粘膜接种感染。攻击感染后6w剖杀各组小鼠8只,计数肝、肺组织荷菌量,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖。结果PCR成功扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6疫苗构建成功。免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-ESAT-6的表达产物在相对分子量(35kDa)处有明显的蛋白表达条带,表达效率为20%,且能被活动性结核病人血清特异识别。鼻腔内接种组的肝、肺组织荷菌量明显低于其他免疫组。疫苗接种组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b明显升高,IgG3和IgE无明显变化;疫苗接种组的脾淋巴细胞明显增殖。结论成功构建了结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗,重组Bb-ESAT-6疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有一定免疫保护作用。     

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定

目的　表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法　采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导目的基因表达。Western blot免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物 ,测定其酶活性并用此纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果　序列分析发现PCR扩得的icl有两个核苷酸突变 ,但均为无义突变。在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS PAGE分析约为 4 7kDa。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。纯化的目的蛋白异柠檬酸裂解酶的酶活性为 16 .7u/mg。双向免疫扩散法测定目的蛋白免疫兔血清的抗体效价为 1 32。结论　研制出的结核分枝杆菌重组ICL具有异柠檬酸裂解酶活性和抗原性 ,重组ICL和抗ICL免疫血清的制备为抗结核分枝杆菌潜伏感染的研究奠定了必要的物质基础。     

γ干扰素释放反应在结核分枝杆菌潜伏感染及结核病诊断中的临床意义

目的 探讨三种结核分枝杆菌抗原刺激外周血单个核细胞（PBMC)后γ干扰素(IFN-γ)释放反应对结核分枝杆菌潜伏感染及结核病的诊断意义。并与结核菌素皮试(TST)进行比较。方法 研究对象共分三组，活动性结核组(57例)，健康对照组(27例)，肿瘤组(29例)，分别用结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)，早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretary antigenic target 6kDa protein ESAT-6)，38kDa抗原与PBMC共同培养5天，后采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中IFN-γ的浓度。结果 ①健康组：TST与BCG接种史及排菌病人密切接触程度呈正相关(B=0．047和P=0．041)，ESAT-6为抗原的IFN-γ释放水平与结核病接触程度密切相关(P=0．005)，而与BCG接种史无明显相关。②当阴阳性界定值定为1000pg／ml时。38kDa抗原刺激后的IFN-γ浓度对于结核病诊断的敏感性为64．9％，特异性为89．3％.结论 ESAT-6刺激后的IFN-γ释放反应对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断意义可能优于TST。38kDa抗原刺激后的IFN-γ释放反应可能有结核病的辅助诊断意义。     

结核分枝杆菌Rv0577基因在毕赤酵母的表达及重组抗原活性鉴定

目的在毕赤酵母表达结核分枝杆菌Rv0577基因并鉴定重组蛋白抗原活性。方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv扩增Rv0577基因,TA克隆进入pGEM-TEasy载体,再亚克隆进入pPICZαA。重组质粒pPICZαA-Rv0577经双酶切鉴定并测序证实,线性化后电转化导入毕赤酵母X-33表达;采用Western blot和Dot blot鉴定抗原活性。结果双酶切及测序鉴定均证实获得Rv0577基因的正确克隆。pPICZαA-Rv0577在X-33分泌表达的目的蛋白,通过硫酸铵沉淀、HPLC顺序纯化,获得的纯化蛋白与结核病患者血清进行Dot blot,7份中有3份反应阳性。结论Rv0577基因在毕赤酵母获得高效表达,重组抗原可被结核病患者血清识别,具有抗原活性。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。     

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。     

Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis

Forty-seven Mycobacterium tuberculosis genes from the 'regions of difference' RD2-7, RD9-13 and RD15 were cloned and expressed, and the purified recombinant proteins were screened for their serodiagnostic potential. Evaluation of six selected proteins in serum samples from Danish resident tuberculosis patients and healthy controls led to identification of Rv0222 as the most promising serodiagnostic antigen. Recognition of the Rv0222 was compared with the 38 kDa protein and a fusion protein of the RD1 proteins ESAT-6 and CFP10 in a serum panel from pulmonary tuberculosis (TB) patients from Uganda. The highest overall sensitivity was observed for Rv0222 compared to BCG-vaccinated non-endemic healthy controls as well as symptomatic endemic controls. Importantly, Rv0222 identified human immuno deficiency (HIV) virus-positive patients and HIV-negative patients with the same overall sensitivity. The results emphasize the importance of cut-off values in TB endemic regions based on endemic control individuals to diagnose active TB, and identify Rv0222 as a promising new antigen for serodiagnosis of TB in both HIV-negative and HIV-positive patients.     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果　重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论　成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的　通过构建结核分枝杆菌（结核菌）CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法　用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上, 在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His - Tag) 镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果　构建了含CFP10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌, 发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP10、Rv2626c蛋白组成联合抗原, ELISA方法检测214份血清, 阳性率达77.1%。结论　目的基因克隆入宿主菌中并表达成功, 重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

Evaluation of vaccines in the EU TB Vaccine Cluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis

The TB Vaccine Cluster project funded by the EU Fifth Framework programme aims to provide novel vaccines against tuberculosis that are suitable for evaluation in humans. This paper describes the studies of the protective efficacy of vaccines in a guinea pig aerosol-infection model of primary tuberculosis. The objective was to conduct comparative evaluations of vaccines that had previously demonstrated efficacy in other animal models. Groups of 6 guinea pigs were immunized with vaccines provided by the relevant EU Vaccine Cluster partners. Survival over 17 or 26 weeks was used as the principal measure of vaccine efficacy following aerosol challenge with H37Rv. Counts of mycobacteria in lungs and spleens, and histopathological changes in the lungs, were also used to provide evidence of protection. A total of 24 vaccines were evaluated in 4 experiments each of a different design. A heterologous prime-boost strategy of DNA and MVA, each expressing Ag85A and a fusion protein of ESAT-6 and Ag85B in adjuvant, protected the guinea pigs to the same extent as BCG. Genetically modified BCG vaccines and boosted BCG strategies also protected guinea pigs to the same extent as BCG but not statistically significantly better. A relatively high aerosol-challenge dose and evaluation over a protracted time post-challenge allowed superior protection over BCG to be demonstrated by BCG boosted with MVA and fowl pox vectors expressing Ag85A.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-CFP21融合蛋白克隆表达及全血IFN-γ的检测

目的构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得CFP21和CFP10-ESAT-6(CE)基因片段,分别连接到pMD18-T,并将两片段2次连接到表达载体pET21a(+)中,获得pET21a-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;经表达纯化和复性后,去除内毒素,利用酶联免疫吸附试验检测48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放量。结果CE21经SDS-PAGE分析后相对分子质量为45,与预期大小一致。CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.9%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3.3%和3.1%。结论成功获得CE21融合蛋白,IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。