人胰岛细胞制备过程中细菌性污染的监测与干预

目的：在胰岛细胞制备过程中监测并预防性使用敏感抗生素。防止、清除制备过程中出现的污染。保证用于移植的胰岛细胞质量，以期减少移植后感染的发生。确保移植进一步用于临床的效果。 方法：体外分离人胰岛细胞实验是于2004-11／2005-10在广州中山大学附属第三医院中心实验室进行。①成人胰岛细胞的分离纯化及其过程中细菌性污染的监测：胰腺取自成人脑死亡尸体。生前无糖尿病及相关病史（家属知情同意），胰腺进行修剪、灌注后，胰岛细胞消化收集中；COBE-2991细胞纯化机纯化胰岛细胞后；体外培养48h后6个步骤取样进行细菌性污染的鉴定，并作药敏实验。②在同样的制备过程中，分别采用青霉素＋链霉素＋两性霉素B或泰能＋两性霉素B进行干预，未施加干预措施作为对照组。③胰岛细胞的功能测定：采用体外胰岛素释放试验，测定纯化培养后未被污染的胰岛细胞功能。 结果：①3组不同处理的胰岛细胞（纯化培养后）的污染率：未用抗生素的对照组为100％、青霉素＋链霉素＋两性霉素B组为50％。泰能＋两性善素B组为0，3组污染率差异有显著性（P〈0．05）。②取培养后未污染的胰岛细胞行体外胰岛素释放试验结果：青霉素＋链霉素＋两性霉素B组、泰能＋两性霉素B组两组胰岛细胞高糖时胰岛素释放量分别是低糖的2．4l和2．36倍（t=4．76，P〈0．05），提示青霉素＋链霉素＋两性霉素B组、泰能＋两性霉素B组胰岛细胞分泌功能良好。两组间的胰岛素敏感指数（ISI）在统计学上差异也无显著性（t=O．31，P=O．76），说明两组抗生素对胰岛细胞功能的影响无差异。 结论：胰岛细胞制备过程中细菌性污染严重。泰能＋两性霉素B的联合应用能有效清除胰岛细胞制备过程中出现的细菌性污染，经泰能＋两性霉素B处理的胰岛细胞行胰岛素释放试验表明分泌功能良好。     

生长激素对体外培养大鼠胰岛的促胰岛素释放功能的影响

【目的】探讨生长激素(GH)对体外培养大鼠胰岛的胰岛素释放功能的影响。【方法】对体外培养大鼠胰岛进行形态学观察及鉴定,分正常对照组及GH干预组,进行胰岛素含量测定及胰岛素释放试验。【结果】HG干预组胰岛培养6d后培养液中胰岛素总量显著高于正常对照组(P<0.05),在低糖及高糖条件刺激下的胰岛素释放量均显著高于正常对照组(P<0.05),两组间的胰岛素释放指数无统计学差异。【结论】GH对体外培养大鼠胰岛的胰岛素释放具促进作用,可能并不会因此加速胰岛功能的衰竭。为进一步探讨GH促进永生化后回复的胰岛细胞功能的恢复,提供了前期实验基础。     

琼脂糖微囊化猪胰岛异种移植治疗糖尿病的实验观察

背景:以往研究表明体外琼脂糖微囊化成猪胰岛具有一定的有效生物活性.但移植到动物体内后的生物活性还有待明确.目的:观察实验性糖尿病大鼠腹腔内移植琼脂糖微囊化成猪胰岛治疗效果.设计,时间及地点:对比观察实验,于2007-12/2008-12在郑州大学中心实验室完成.材料:以琼脂糖作为制备微囊的材料,用相分离方法包被成猪胰岛.方法:①将纯化后未微囊化胰岛及微囊化胰岛分置于RPMI1640培养液培养, 隔日换液.收集培养第1天及第5天培养液上清,检测胰岛素含量.②解剖镜下挑选同一时间微囊的胰岛细胞,分别置于5.6 mmol/L葡萄糖、16.6 mmol/L葡萄糖和10.0 mmol/L茶碱溶液中,做静态孵育下的胰岛素刺激释放试验,放射免疫法测定胰岛素含量.③27只糖尿病大鼠随机分为3组:对照组、未微囊化胰岛移植组、微囊化胰岛移植组,分别注入生理盐水、(0.9～1.6)×103个未微囊化成猪胰岛、(0.8～1.7)×103个微囊化成猪胰岛.主要观察指标:微囊化胰岛培养液中基础胰岛素含量变化,微囊化胰岛对高糖与茶碱刺激的反应性,胰岛移植后糖尿病大鼠的生存期.结果:微囊化胰岛在1个月的培养期间可持续分泌胰岛素.囊内细胞生长良好,微囊没有溶解和破碎.培养2 d的微囊化胰岛对高糖与茶碱刺激有明显反应,胰岛素释放量分别为低糖的1.96倍和2.58倍(P<0.01).移植后7d时,3组血糖分别为(21.61±1.21)mmol/L,(19.11±2.39)mmol/L和(13.67±1.43)mmol/L,微囊化胰岛移植组与前2组相比差异均有显著性意义,且生存期明显长于前2组.结论:琼脂糖微囊化成猪胰岛可存活于糖尿病大鼠体内,并且具有有效生物活性.     

大鼠胰岛细胞的分离提纯及移植效果观察

背景:胰岛细胞移植已成为治疗1型和部分2型糖尿病的有效途径,但供体不足的问题限制了其发展。目的:改进胰岛细胞的分离和纯化方法,并观察其移植效果。设计:实验方法改进。单位:中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室。材料:实验于2006-01/10在中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室完成。供体为普通级封闭群Wistar大鼠,雌雄不限,体质量250～300g;受体为普通级封闭群SD大鼠,雄性,(Frompage2388)体质量180～220g,两种大鼠均购自中国医科大学实验动物部(许可证号:SYXK(LIAO)2003-0013)。方法:①胰岛细胞的分离纯化及胰岛功能评估:取未禁食的Wistar大鼠,麻醉后处死。于胆总管起始处剪一小口,将连着装有胶原酶的注射器的1mm直径的腰麻管顺行插入,将冷的胶原酶溶液(1.5g/L)注入胰管内,使胰腺充分膨胀。切取胰腺,将装有胰腺的离心管水浴消化,水浴期间间断加入1mol/L的NaOH使消化液的pH值保持在7.8±1.0,经Ficoll密度梯度离心法纯化胰岛。应用双硫腙法评估胰岛的纯度,应用丫啶橙/碘丙啶法评估胰岛的存活率,存活率=活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)×100%。通过胰岛素释放实验检测胰岛活性:胰岛素释放指数=第3小时(高糖环境)的胰岛素含量/第2小时(低糖环境)的胰岛素含量。②胰岛移植效果的观察:受体SD大鼠腹腔内注射链脲霉素,非禁食状态下2次血糖>16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠按随机数字表法分为两组,即胰岛移植组和糖尿病组,每组8只。胰岛移植组于肾被膜下注射约1000个胰岛,糖尿病组注射相应体积的1640培养液,再随机取8只血糖浓度≤5.5mmol/L的SD大鼠作为正常对照组。术后每天检测大鼠血糖,以非禁食血糖小于11.1mmol/L者视为胰岛移植存活。胰岛移植组大鼠血糖正常3d后对胰岛移植组、糖尿病组和正常对照组大鼠分别进行静脉糖耐量试验,测定0,15,30,60,90及120min血糖。主要观察指标:胰岛的纯度、存活率及活性。结果:纳入受体SD大鼠24只,全部进入结果分析,无脱失。①平均每只大鼠胰腺可获得(1150±141)个胰岛,纯度>95%,存活率>98%,胰岛形态完好。②体外胰岛素释放实验低、高糖组的胰岛素释放量为(70.5±6.9)mIU/L,(321.4±11.6)mIU/L,胰岛素释放指数为4.60±0.52,提示所提取的胰岛β细胞有良好的功能。③胰岛移植组大鼠胰岛移植当天血糖既开始下降,3d后血糖下降至正常,维持正常血糖水平(6±2)d;而糖尿病组大鼠血糖均在16.7mmol/L以上。胰岛移植组静脉葡萄糖耐量试验曲线与正常对照组相似。结论:经原位灌注法分离、Ficoll密度梯度离心纯化的胰岛制备技术可以获得高纯度和活力良好的大鼠胰岛细胞。     

成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养及其诱导分化

目的 探讨成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养、扩增及诱导分化为具有分泌胰岛素功能的B细胞的条件。方法 首先通过胶原酶消化的方法从成人胰腺组织中分离纯化出胰岛,在含有bFGF及EGF的增殖培养基中大量扩增获得Nestin阳性前体细胞,最后在含有HGF、activin-A、exendin-4等生长因子的培养基中诱导该前体细胞。结果 来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞在体外可以大量扩增并表达ABCG2,而胰岛素不表达。在分化培养基中能分化为对高糖刺激反应的胰岛B细胞,胰岛素呈现阳性。结论 来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞能够为今后糖尿病的细胞移植治疗提供大量有功能的B细胞,能够解决目前胰岛移植中供体来源不足的问题。     

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。 目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。 设计：随机对照观察。 单位：中日友好医院临床医学研究所。 材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。 方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。 主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。 结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。 结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的探寻提高大鼠胰岛细胞分离纯化技术的方法。方法通过用胶原酶灌注及不连续密度梯度离心法分离纯化胰岛细胞,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后每只胰腺获得（768±135）个胰岛细胞,纯度为（81.5±11.6）%;纯化后细胞形态完好,活度大于92%。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为（23.16±4.13）mU/L,高糖情况下为（36.82±4.34）mU/L,两者有显著性差异（P〈0.05）。胰岛移植后,实验组48 h后血糖值降至正常。结论用胰管内胶原酶灌注及不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度、功能均良好的胰岛细胞。     

聚乙醇酸生物支架与胰岛的共培养

背景:以往的研究表明,胰岛细胞体外培养的时间不宜过长,否则会出现纤维组织过度增生,使胰岛大量死亡,而导致移植失败,所以改善胰岛细胞体外培养环境是非常重要的.目的:将大鼠胰岛种植在聚乙醇酸生物支架上,并进行胰岛与支架共培养,观察支架上胰岛细胞的生长状态、胰岛细胞的形态和胰岛细胞的分泌功能,以寻找胰岛细胞体外生存的良好环境.设计、时间及地点:体外培养,对比观察实验,于2005-06/2008-12在哈尔滨医科大学附属第一医院,卫生部细胞移植重点实验室完成.材料:聚乙醇酸支架纤维直径15 μ m,网孔100～150 μ m,空隙率为97%,厚度为1.0～2.0 mm.细胞培养前将支架浸泡入体积分数为75%乙醇溶液中 30 min,PBS冲洗3次,吹干后放入2 g/L多聚赖氨酸中浸泡30 min,消毒后备用.方法:采用胶原酶V分离和消化大鼠胰岛,对照组胰岛加入含体积分数20%胎牛血清、10 g/L肯霉索-链霉素-两性霉素、10 mmol/L Hepes的RPMI-1640培养液;支架组胰岛放在多聚赖氨酸包被的聚乙醇酸支架上,再加入同样的培养基,每个培养肌中细胞浓度为0.6×103,将两组细胞置于体积分数5%CO2、37℃的恒温培养箱中培养.主要观察指标:应用双硫腙胰岛特异性染色,计算胰岛的数量及检测胰岛的纯度;MTT法检测胰岛的成活率;放射免疫法测定胰岛细胞培养上清液中的胰岛素含量;并用扫描电镜对支架上胰岛的黏附生长进行观察.结果:分离和消化后的胰岛被双硫腙染成红色,胰岛外分泌腺不着色,胰岛纯度≥85%:MTT及胰岛功能检测结果显示,支架组的胰岛成活率及胰岛功能明显增高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05);扫描电镜观察,胰岛紧密黏附存聚乙醇酸支架上,支架卜胰岛成三维立体生长.结论:聚乙醇酸支架与大鼠胰岛共培养可改善胰岛的成活率、胰岛的功能及形态,并使胰岛体外生存期延长.     

促胰素对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响

背景:有研究报道,促进胰岛β细胞增殖分化和再生是2型糖尿病患者一种潜在的治疗方案。目的:观察促胰素对体外培养大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响。方法:采用胶原酶消化和组织培养法分离纯化大鼠胰岛细胞,检测其纯度和活性,将胰岛细胞分为空白对照组和实验组,空白对照组加入普通培养基,实验组培养基中加入不同质量浓度(100,200,300,400mg/L)促胰素,培养1,3,5d后CCK-8法检测细胞增殖活性;培养5d后行低糖和高糖刺激胰岛素释放实验。结果与结论:随着促胰素质量浓度的增高,胰岛细胞增殖活性呈剂量依赖性增加(P<0.05),但无明显时间依赖性。除100,200mg/L组外,300,400mg/L两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P<0.05)。表明300,400mg/L促胰素不仅可促进胰岛细胞增殖,而且可显著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能。     

体外延长胰岛培养时间的实验

目的分离纯化大鼠胰岛,探索胰岛体外长期培养的新方法,为胰岛移植治疗糖尿病提供数量多、质量好的胰岛。方法实验于2002-12/2004-03在哈尔滨医科大学组织工程与发育生物学研究室完成。①取16～22d龄,体质量80g的雄性W istar大鼠睾丸支持细胞。②采用改良的胰管内顺行灌注胶原酶消化体质量200～250g的W istar大鼠胰腺,Ficoll不连续浓度梯度纯化,手挑法检出全部胰岛,用双硫腙鉴定胰岛。③分为胰岛单独培养组和胰岛与支持细胞联合培养组,应用倒置显微镜和荧光显微镜观察单独培养组和联合培养组的胰岛形态和存活率,在培养的第3,7,14,28天用放射免疫法测定胰岛素分泌量,并通过胰岛素释放实验计算刺激指数。结果①胰岛的回收率回收率为53.6%,纯度为100%。②两组胰岛存活率的比较联合培养组的胰岛存活率显著高于单独培养组[培养14d84%,3%;培养28d82%,0(P<0.01)]。③两组累积胰岛素分泌量及刺激指数比较联合培养组胰岛素分泌量显著高于单独培养组[培养7d(105.0±11.6),(48.0±5.3)m IU/L(P<0.01)],刺激指数也显著高于单独培养组(培养7d6.1±0.7,1.1±0.2)(P<0.01)。结论通过胆总管顺行注入胶原酶进行消化,Ficoll不连续密度梯度离心法进行胰岛纯化,体视镜下手挑胰岛,胰岛的回收率和纯度较高。睾丸支持细胞与胰岛联合培养可以促进胰岛生长,显著延长存活时间,是一种较好的体外长期培养胰岛的方法。