克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549^DDP耐药相关基因的差异表达片段

目的：克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示法技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549^DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序,同源性分析,其中2个片段（A1、D1）在GeneBank中未发现同源序列,一个片段（A2）与白介素－1β转化酶（Interleukin 1 β怀脲,ICE）89％同源性,一个片段（D2）与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100％同源。A1、A2cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2cDNA片段仅表达于A549^DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549^DDP间的基因差异3表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

人肺腺癌细胞耐顺铂株A549/CDDP的比较蛋白质组学研究

背景与目的 化疗是肺癌综合治疗的重要部分,但是肿瘤细胞耐药常导致化疗失败.本研究采用蛋白组学方法研究人肺腺癌细胞A549对顺铂产生耐药性前后的蛋白表达差异,筛选有价值的靶位.方法 以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的方法,诱导建立耐顺铂细胞株A549/CDDP.对A549与A549/CDDP进行蛋白组学研究,即利用双向凝胶电泳(2-DE)分离两组总蛋白后,通过图像分析寻找表达差异的蛋白,对其进行MALDI-TOF质谱分析.结果 比较两者2-DE图谱,得到差异蛋白点82个;对其中6个差异蛋白点进行肽质量指纹图分析,鉴定出葡萄糖调节蛋白75、核糖体蛋白S4、线粒体F1-ATP合酶β亚单位、免疫球蛋白重链可变区;以上差异蛋白均在耐药株中过表达,而在对照组细胞中表达下调或不表达.结论 所鉴定的差异蛋白将为阐明肺癌细胞对顺铂耐药性产生的机制提供线索,也为筛选具体潜在价值的肺癌化疗靶位提供理论依据.     

P型铜转运ATP酶(ATP7B)在肺腺癌细胞株A549中的表达与顺铂耐药的关系

背景与目的 顺铂作为肺癌的基础化疗药物,顺铂耐药是导致肺癌患者化疗失败的重要原因.本实验通过检测P型铜转运ATP酶在肺腺癌细胞A549不同水平耐药株中的表达,以评估ATP7B与A549细胞顺铂耐药的关系.方法采用逐步增加顺铂剂量的方法,诱导出3株不同水平耐顺铂A549细胞株A549/DDP0.5、A549/DDP1.0、A549/DDP2.0,MTT方法检测各组别细胞对顺铂敏感性,应用RT-PCR及Western Blot方法分别检测各组别细胞的ATP7B的mRNA及蛋白表达水平,分析A549细胞顺铂敏感性与ATP7B表达水平的关系.结果相对于亲本A549细胞,3组耐药细胞的顺铂耐药指数分别达到了1.7、3.2、5.2(P＜0.001),与此相对应ATP7B的mRNA表达水平分别达到了亲本A549细胞的1.6、4.9、10.1倍(P＜0.001),同样地ATP7B的蛋白表达水平也呈现出与顺铂耐药性相平行的递增性高表达.结论肺腺癌细胞A549的顺铂耐药与细胞ATP7B高表达有关,后者的高表达有可能促成了A549细胞的获得性顺铂耐药.     

耐顺铂人肺腺癌细胞系A549^DDP耐药机理进一步探讨

应用递增浓度的方法建立了一株顺铂（ＣＤＤＰ）耐药细胞系Ａ５４９ＤＤＰ。用溴化乙啶荧光分光光度法测定细胞内Ｐｔ－ＤＮＡ链间交联物（ＩＣＬ）；用无焰原子吸收光谱法测定细胞浆内及细胞核内铂含量；用流式细胞法及荧光显微镜测定铂的外排速度。结果显示：耐药细胞Ａ５４９ＤＤＰ较亲代敏感细胞Ａ５４９对ＣＤＤＰ耐受性增加８．９倍，与亲代敏感细胞Ａ５４９相比，Ａ５４９ＤＤＰ胞浆内及核内ＣＤＤＰ积聚分别为亲代细胞的１６．９％与２４．３％，铂含量与ＣＤＤＰ浓度正相关；Ａ５４９ＤＤＰ外排ＣＤＤＰ的功能较Ａ５４９明显增强，ＩＣＬ形成量低８４．１％，而修复功能增强２倍。结果提示：Ａ５４９ＤＤＰ细胞内ＣＤＤＰ积聚减少和修复功能增强是ＣＤＤＰ的主要耐药机理。     

RNA干扰ERCC1基因表达对肺腺癌细胞A549/DDP顺铂耐药的影响

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)的表达可能与DDP耐药有关.本研究旨在探讨小干扰RNA沉默ERCC1基因表达对肺腺癌耐药细胞A549/DDP药物敏感性的影响.方法将体外设计合成针对ERCC1的小分子RNA(siRNA)转染A549/DDP细胞,RT-PCR检测ERCC1 mRNA水平;Western blot检测ERCC1蛋白表达的变化;MTT检测RNA干扰后细胞药物敏感性改变.结果 ERCC1 RNAi干扰后ERCC1 mRNA表达指数降低,明显低于对照组,干扰后ERCC1 mRNA表达抑制率为90.4%.转染ERCC1 siRNA降低TERCC1蛋白的表达水平.MTT显示分别用2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL顺铂处理细胞48 h,转染ERCC1 siRNA细胞组较对照组敏感性明显增高,干扰前A549/DDP细胞IC50为12.49μg/mL,干扰后A549/DDP细胞IC50下降为9.27 μg/mL.结论 ERCC1siRNA干扰可以降低ERCC1的表达水平,并可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性.     

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等;DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带;ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05);而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。     

GRP78在肺腺癌细胞顺铂耐药中的作用

背景与目的糖调节蛋白78(GRP78)在肺癌细胞中表达增高并与其对化疗药物VP-16的耐药性有关,而GRP78的表达与其对化疗药物顺铂的耐药性是否相关,研究较少。本研究旨在通过检测GRP78在人肺腺癌细胞SPCA-1中的表达及顺铂作用后的细胞生存率,研究GRP78在肺腺癌细胞顺铂耐药中的作用。方法依据是否应用诱导剂A23187将细胞分为实验组和对照组,采用RT-PCR、Western blot方法检测各组细胞中GRP78在核酸和蛋白水平的表达,利用MTT法测定细胞在顺铂作用下的生存率,分析GRP78在SPCA-1细胞顺铂耐药中的作用。结果A23187可以明显诱导SPCA-1细胞中GRP78在核酸和蛋白水平的表达,且其表达水平与A23187具有一定的浓度依赖性,MTT检测显示:实验组细胞生存率明显低于对照组,亦呈一定的A23187浓度依赖性。结论在人肺腺癌细胞SPCA-1中,诱导剂A23187可以诱导GRP78核酸和蛋白水平的表达,其表达与肺癌细胞在顺铂作用下的生存率呈负相关,表明GRP78可提高SPCA-1细胞对顺铂的敏感性,与肺癌细胞化疗耐药有一定的相关性。     

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９／ＤＤＰ耐药细胞的多药抗药机理。方法;应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位ＤＮＡ断裂点的末端标记法观察细胞亡的状况,用免疫组化法检测ｂｃｌ－２基因的表达。结果：癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改革。３μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ,７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９细胞ＤＮＡ裂解片断呈现典型的阶梯状排列条喧,而在５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９／     

CXCR4的表达与肺腺癌顺铂耐药的临床研究

摘 要：［目的］ 分析CXCR4在肺腺癌中的表达及其与铂类耐药的关系。［方法］ 采用免疫组化SP法检测CXCR4在71例ⅢA期肺腺癌中的表达,分析其表达与肺腺癌顺铂耐药及预后的关系。［结果］ CXCR4在71例ⅢA期肺腺癌中的阳性表达率为85.9%。耐药组肺癌患者与敏感组相比,CXCR4表达升高,且预后差,两组比较差异有统计学意义(P<0．05)。［结论］CXCR4蛋白阳性表达与ⅢA期肺腺癌顺铂耐药有关。     

托瑞米芬协同顺铂对人肺癌细胞株A549的影响

目的：研究托瑞米芬（TOR）对人肺腺癌细胞系A549的毒性作用及其与顺铂（DDP）联用的协同效应,探讨肺癌综合治疗的方向。方法：用MTT显色法检测TOR及与DDP联用后对A549细胞的毒性作用,测定其吸光度（A）值。用流式细胞仪检测细胞DNA含量,Western blot法检测p21蛋白表达。结果：TOR能直接抑制A549细胞的生长,≥5μmol/L的TOR可明显增强DDP的细胞毒性作用。TOR可加强DDP对S期、G2期及M期细胞的作用,且DDP＋TOR后p21蛋白表达增加。结论：≥5μmol/L的TOR与DDP联用对A549细胞具有显著的协同抗肿瘤效应。     

HSV-TK与IL-2共表达真核载体的构建及 其在A549细胞中的表达

 目的构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和人类细胞因子白细胞介素-2(IL-2)的联合表达质粒载体并观察其在人类肺腺癌细胞系A549细胞中的表达。方法设计、合成多克隆位点（MCS）插入到质粒pSNAV中,然后分别从其他不同的质粒剪切片段HSV-TK、内部核糖体进入位点(IRES)、IL-2并依次接入到MCS中,最终得到目的质粒pSNAV-TK-IRES-IL2(pMTⅡ)。目的质粒经酶切、DNA测序鉴定正确后,转染到A549细胞中。用RT-PCR方法、ELISA法检测转染后细胞目的基因的转录和表达;进一步倒置显微镜观察、MTT法检测更昔洛(GCV)对转然后细胞的杀伤作用。结果经酶切、DNA测序、RT-PCR法和ELISA法鉴定,双基因真核表达载体pMTⅡ序列正确并能有效表达。进一步倒置显微镜观察和MTT法检测表明HSV-TK/GCV自杀基因系统对A549细胞有明显的杀伤作用。结论成功构建了pMTⅡ真核表达载体,并观察了其对A549细胞的杀伤效应,为进一步研究HSV-TK/GCV联合IL-2基因治疗肺癌提供实验基础。     

二甲双胍对肺腺癌细胞Nrf2基因表达的调控作用研究

目的探讨Nrf2基因在对顺铂耐药的肺腺癌细胞中的表达及二甲双胍对其调控作用的研究。方法应用细胞增殖实验(CCK-8)和流式细胞仪,检测二甲双胍对肺腺癌A549和A549/DDP细胞增殖抑制率、凋亡率,RealtimePCR检测相关耐药基因表达,Western Blot法检测相关蛋白水平表达。结果 Nrf2、GSTA1、ABCC1等基因在A549、A549/DDP细胞间表达存在显著差异,在A549/DDP细胞中呈高表达;二甲双胍能够抑制A549、A549/DDP细胞Nrf2及下游GSTA1、ABCC1基因的表达,并进一步抑制细胞增殖和诱导A549/DDP细胞凋亡。结论 Nrf2基因及下游基因在肺腺癌细胞不同细胞株表达存在差异,二甲双胍可影响其表达。     

低氧上调肺腺癌细胞中Annexin A1的表达

背景与目的肿瘤的生长通常会面临缺血缺氧,已有的研究表明膜联蛋白Anx A1(Annexin A1)与肿瘤的关系密切,本研究旨在探讨低氧对肺腺癌细胞Anx A1表达的影响。方法将人肺腺癌细胞A549扩增后,分别在常氧(37oC、5%CO2、21%O2)和低氧(37oC、5%CO2、1%O2)条件下培养4 h、12 h、24 h,随后进行RT-PCR,观察Annexin A1 mRNA水平的变化,Western blot方法观察蛋白表达的变化;测定各组细胞中活性氧(reactive oxygen spe-cies,ROS)的含量,Western blot检测NF-κB核转位;分别以ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)干预后,测定各组细胞中Anx A1蛋白水平的变化。结果 RT-PCR结果显示低氧4h后Anx A1 mRNA水平上升,与常氧组比较有统计学差异(P<0.05),但随后缓慢下降;Western blot结果显示低氧上调A549细胞中Anx A1蛋白的表达,在缺氧4 h时尤为明显;随着细胞缺氧时间的延长,ROS的量也逐渐递增;ROS清除剂NAC和NF-κB抑制剂PDTC明显降低缺氧所致的Anx A1蛋白水平增加。结论低氧上调肺腺癌A549细胞中AnnexinA1 mRNA和蛋白水平的表达,ROS-NF-κB信号通路可能参与这一过程。     

Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞的协同抗肿瘤作用

背景与目的 Amorphigenin是从紫穗槐属植物的种子中分离提取的鱼藤酮类化合物,研究发现amorphigenin对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用。本研究拟探讨amorphigenin对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的抗肿瘤作用及其可能的分子机制。方法采用CCK-8法测定A549/DDP细胞的增殖;克隆形成实验测定A549/DDP细胞的克隆形成;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot技术检测caspase-3、PARP和LRP蛋白的表达。结果Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞的增殖48 h[半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentra-tion, IC50）]为（2.19±0.92）μmol/L、抑制克隆形成及诱导细胞凋亡。此外,Amorphigenin与顺铂联合可协同地抑制A549/DDP细胞生长和促进凋亡;降低耐药蛋白LRP蛋白的表达。结论 Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞增殖和促进细胞凋亡;amorphigenin可能是通过抑制耐药蛋白LRP蛋白表达,进而与顺铂对A549/DDP细胞产生协同抑制作用。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布联合顺铂对A549人肺腺癌细胞株增殖影响的体外实验研究

目的观察环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布（Celecoxib）与化疗药物顺铂（DDP）联合应用对A549人肺腙癌细胞增殖的影响。方法应用MTS法检测Celecoxib与DDP联用对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。结果在一定浓度范围内，Celecoxib和DDP均可抑制A549人肺腺癌细胞的生长，其抑制作用呈量-效关系。Celecoxib（0．35mg／L）与DDP联用可增强对A549细胞生长的抑制作用，DDP浓度≥1mg／L时两者具有协同或相加作用；且在一定浓度范围内，Celecoxib与DDP联用对细胞的生长抑制作用呈时-效关系。结论Celecoxib与DDP联合可增强对A549人肺腺癌细胞的生长抑制效应。     

Triptolide Inhibits Histone Methyltransferase EZH2 and Modulates the Expression of Its Target Genes in Prostate Cancer Cells

The histone methyltransferase EZH2 (enhancer of zeste homolog 2) plays critical roles in prostate cancer(PCa) development and is a potential target for PCa treatment. Triptolide possesses anti-tumor activity, but itis unknown whether its therapeutic effect relates with EZH2 in PCa. Here we described EZH2 as a target forTriptolide in PCa cells. Our data showed that Triptolide suppressed PCa cell growth and reduced the expressionof EZH2. Overexpression of EZH2 attenuated the Triptolide induced cell growth inhibition. Moreover, Triptolidetreatment of PC-3 cells resulted in elevated mRNA levels of target genes (ADRB2, CDH1, CDKN2A andDAB2IP) negatively regulated by EZH2 as well as reduced mRNA levelsan of EZH2 positively regulated gene(cyclin D1). Our findings suggest the PCa cell growth inhibition mediated by Triptolide might be associated withdownregulation of EZH2 expression and the subsequent modulation of target genes.     

应用基因表达谱芯片从抗脱落凋亡肺癌A549细胞中筛选转移相关基因

背景与目的正常上皮或内皮细胞脱离细胞外基质会发生脱落凋亡,但肿瘤细胞可不依赖细胞基质生长而不发生凋亡,这一现象被称为抗脱落凋亡,目前国内外相关研究均认为抗脱落凋亡是肿瘤发生转移的始动环节。本实验旨在比较抗脱落凋亡及正常贴壁生长肺腺癌A549细胞基因组表达差异,从中筛选肺癌转移相关基因。方法利用多聚羟乙基甲基丙烯酸树脂处理培养皿,致细胞无法贴壁生长,建立抗脱落凋亡肺癌A549细胞系;利用北京博奥生物芯片公司的人类V2.0全基因组寡核苷酸微阵列芯片,检测其与正常贴壁生长A549细胞的基因表达差异性,筛选肺癌转移相关基因。结果共得到表达差异的基因745个,从中筛选出63个与肺癌转移密切相关的基因。结论成功建立抗脱落凋亡肺癌A549细胞系并筛选出转移相关差异表达基因,为进一步研究肺癌转移相关信号转导通路及其它相关研究提供依据。     

结肠腺癌中膜联蛋白A5的表达及其临床意义

[目的]研究膜联蛋白A5(Annexin A5)在结肠腺癌组织中的表达水平及其与临床病理因素之间的关系。[方法]应用蛋白质印迹法(Western blot)和S-P免疫组化法检测结肠腺癌组织和相应癌旁正常组织中Annexin A5表达状况。[结果]Annexin A5在结肠腺癌组织中的表达水平及阳性表达率均显著高于相应癌旁正常组织中的表达,差异具有显著性(P<0.05)。进一步研究表明,Annexin A5表达与肿瘤大小和患者是否发生淋巴结转移有关(P<0.05)。[结论]Annexin A5在结肠腺癌的形成和转移中有着重要作用,有望成为结肠腺癌临床治疗的新靶标。     

Empirical Study on Chemotherapeutic Susceptibility of SP Cells in Human Pulmonary Adenocarcinoma Cell Line A549 in Vitro

OBJECTIVE To explore the chemotherapeutic susceptibility of SP cells in human pulmonary adenocarcinoma cell line A549 and the possible mechanism of multidrug resistance.METHODS SP and non-SP (NSP) cells in the cell line A549 were isolated by fluorescence activated cell sorter. The susceptibility of SP and NSP cells to DDP, 5-FU, VP16, NVB and GEM was detected by a drug susceptibility test, and IC50s were calculated 24 h a er the chemotherapy; and then a er a 2-hour IC50 treatment with 5 chemotherapeutic drugs on the 2 subsets of NSP cells, the intracellular drug levels were determined and analyzed using high performance liquid chromatograph.RESULTS There was no statistical signifi cance in comparison of the di. erences in IC50s and in intracellular drug levels a er DDP treatment between the 2 subsets (P > 0.05), (P > 0.05). However,all IC50s of the other 4 drugs were significantly higher in the SP cells than in the NSP cells (P < 0.01). A er the chemotherapy, the intracellular drug levels of the other 4 drugs were significantly lower in SP cells than in NSP cells (P < 0.01).CONCLUSION Compared to NSP cells, SP cells in the cell line A549 have stronger resistance to the chemotherapeutics. The multidrug resistance of SP cells closely correlates with the function of SP cells discharging chemotherapeutic agents.