结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体,并进行表达,纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后,经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB,并获得GIcB重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因,并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后,经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％,Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873,并获得重组Rv3873蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体。然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家免,取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。获得纯度为90％的重组蛋白。纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌CFP10的基因克隆及表达

目的克隆结核分枝杆菌CFP10基因,在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究其在结核病诊断中的价值奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对CFP10的基因进行扩增,以PET-30a(+)为载体构建重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α中,抽提质粒,进行双酶切鉴定,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的CFP10重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因克隆以及表达

目的克隆结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对Hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的Hsp16.3重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

蛔虫抗菌肽Cecropin P1基因在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的设计合成蛔虫抗菌肽基因序列,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,以获得重组蛋白。方法根据大肠埃希菌对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性,对蛔虫抗菌肽Cecropin P1编码基因进行改造,人工合成目的基因,克隆到原核载体PMD-18T,并转化DH5α感受态菌株;构建重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并转化BL21感受态菌株;用双酶切鉴定阳性克隆;含有正确重组质粒的阳性菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果PCR扩增及构建的两个重组质粒双酶切鉴定,均获得113bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE电泳分析显示,含有重组质粒PET-30a-Cecropin P1的阳性菌株在IPTG诱导下高效表达了分子质量单位为3.4ku的蛋白质。结论成功构建了重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中以包涵体形式高效表达,为进一步研究蛔虫抗菌肽的生物学活性奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv基因glcB的克隆、表达及酶活性的实验研究

目的应用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达有活性的结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB(80.4kDa),为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制提供理论依据。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌的基因glcB(Rv1837c),并与克隆载体PCR4BLUNT-TOPO连接,DNA测序后,经酶切将glcB与表达载体pET23b连接,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达目的蛋白GlcB。IPTG诱导表达,破菌,离心,采用Ni2+亲和层析法纯化上清液中的目的蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的表达及纯度;同时应用抗6个组氨酸的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot),并进行了酶活性的分析。结果PCR产物序列正确,GlcB可在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中高效表达,可溶性好。经SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色及Western blot检测证实,表达的重组蛋白纯度高,与预期的GlcB大小一致,约80kDa。活性分析提示该重组蛋白具有苹果酸合成酶的功能,且酶活性为5.5μmol/(min·mg),与相关的文献报道一致。结论结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB能够在大肠杆菌中高效表达,且具有酶活性,有望为新一代抗结核药物的研制及结核早期诊断提供依据。     

HIV-1 Vif的克隆、表达与活性检测

目的克隆HIV-1Vif基因,构建原核表达质粒,进行蛋白的表达及其生物学活性的检测。方法 PCR扩增Vif基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)/Vif,进行双酶切及测序鉴定。获得的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,利用亲和层析方法纯化Vif蛋白。利用Pull-Down方法检测HIV-1Vif与SH3(HCK)特异性结合活性。结果通过酶切和测序,结果表明重组质粒pET28a(+)/Vif构建正确。SDS-PAGE和Western blot结果鉴定了原核表达的Vif重组蛋白大小正确。纯化了蛋白Vif、SH3和GST。GST pull-down试验说明Vif和SH3蛋白具有体外特异性结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了Vif蛋白,Vif与SH3蛋白具有结合活性,为进一步研究针对Vif与SH3结合的药物筛选提供实验依据。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。     

细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测

目的 以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性。方法 运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树和二级结构、三级结构等方面进行分析后,将EgGAPDH基因亚克隆于表达载体pET30a(+),转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,表达、纯化重组蛋白,并利用底物3-磷酸甘油醛测定重组蛋白EgGAPDH的酶催化活性。结果 EgGAPDH cDNA序列长度为1 011 bp,编码一个336个氨基酸的蛋白。该GAPDH蛋白理论相对分子质量为36 128.3 Da,等电点为8.44,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域,富含6种类型的特定功能位点。成功构建的原核表达载体pET30a(+)-EgGAPDH在E.coli BL21(DE3)中高效表达,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清,制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活检测显示其具有高效酶活性。结论 EgGAPDH基因可在原核系统中获得有酶催化活性的高效表达,为进一步研究其在糖代谢中的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌RD1区rv3873基因的原核表达及其产物的细胞免疫特性初步分析

目的克隆表达结核分枝杆菌RD1区Rv3873蛋白并初步分析其细胞免疫特性。方法应用PCR技术扩增rv3873基因,插入表达载体pET30a(+),构建原核表达重组质粒pET-Rv3873,重组质粒在宿主菌BL21(DE3)诱导表达,利用表达的蛋白腹腔注射免疫小鼠,以细胞增殖和ELISPOT试验测定融合蛋白的细胞免疫应答。结果克隆的rv3873测序与已发表序列100%同源,融合蛋白大小43ku,淋巴细胞增殖实验显示该蛋白能引起小鼠T细胞免疫反应,ELISPOT实验结果表明多肽pep3873刺激特异性IFN-γ分泌细胞多于IL-4分泌细胞。结论成功地克隆表达了Rv3873蛋白,并发现该蛋白具有良好的细胞免疫特性。     

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌（H.hepaticus）甲基基团接受趋化信号转导蛋白（MCP）基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b（＋）,构建MCP的原核表达质粒pET22b＋/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b＋/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。