单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能。 方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况。提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证。结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株（69.6%）检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株。Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml;而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关。在对照组和转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为 8 μg/ml,而转入pEASY-E1-Rv2936和 pEASY-E1-Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16 μg/ml。结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因。     

聚合酶链反应－单链构象多态性用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系。方法以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析了４０株结核分支杆菌临床分离株。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法由ＰＣＲ扩增和扩增产物ＤＮＡ单链多态性分析组成。结果两对引物ＰＣＲ扩增产物分别为４１１和２５８ｂｐ，其敏感性分别为５ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ和１ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ；均为属特异性。４０株结核分支杆菌临床分离株２５８ｂｐ扩增片段ＳＳＣＰ图谱的特点：以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，１０株敏感株均无区别；单耐ＲＦＰ或包括ＲＦＰ多种抗结核药３０株，除３株外，其余２７株ＳＳＣＰ图谱有明显的区别；检测阳性率为９０％，特异性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可检测出耐ＲＦＰ结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变；该基因是ＲＦＰ的药物靶编码基因，它的突变与ＲＦＰ耐药性有密切关系，这有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究     

多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌

目的　建立耐异烟肼 (isoniazid ,INH )结核分枝杆菌多重聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (multiple polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,multi PCR SSCP)方法 ,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况 ,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性。方法　根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列 ,分别设计出 3对特异性寡聚核苷酸引物 ,采用multi PCR及SSCP技术 ,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这 3个基因的突变情况。结果　对H3 7Rv标准株、临床分离INH敏感株 (2 3株 )及INH耐药株 (3 5株 )分别采用常规PCR和multi PCR同时进行扩增 ,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段 ,且结果符合率达10 0 % ;采用单基因PCR SSCP ,aphC启动子序列突变检出率 17% (6/3 5)、inhA序列突变检出率 2 0 % (7/3 5)、katG序列突变检出率 66% (2 3 /3 5) ;multi PCR SSCP突变检出率 83 % (2 9/3 5)。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,multi PCR SSCP方法敏感、特异 ,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变 ,提高检验效率 ,有望成为临床指导用药的好方法。     

诱导结核分枝杆菌耐katG基因突变过程的分析

目的 在体外建立诱导结核分枝杆菌耐异烟肼药物产生的全过程,分析结核分枝杆菌产生耐药的机理.方法 对结核分枝杆菌强毒株(H37RV)进行诱导试验,与30株临床耐异烟肼药物分离株共同做聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析.结果 在第7代H37RV的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实发生kat...     

单链构象多态性与核酸杂交联合检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌

目的探讨聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）并Southern杂交检测耐氧氟沙星（OFLX）结核分枝杆菌的可行性，并探索结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药的界限。方法（1）体外筛选人工诱变的耐OFLX的耐药突变株，并检测OFLX对这些耐药株的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。（2）扩增结核分枝杆菌的gyrA基因，包括H37 Rv1株、H37 Ra 1株、临床分离的OFLX敏感株10株及人工诱变的耐OFLX H37 Rv（17株）、H37Ra（17株）及临床分离菌株（51株）共计85株，并对此扩增产物进行SSCP分析及Southern杂交，对比观察耐OFLX结核分枝杆菌的核酸单链条带位移的变化。为了验证PCR-SSCP并Southem杂交结果的可重复性，对36株临床分离的耐OFLX菌株的耐药界限进行初步检测。结果经PCR-SSCP及Southern杂交，85株人工诱变的耐OFLX菌株，全部检测到gyrA基因突变。在OFLX 10μg／ml这一点上，明显地存在着一个结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药并存的交叉区。对36株临床分离的OFLX耐药菌的PCR-SSCP合并Southem杂交检测结果显示，对比标准株H37Ra，在临床分离的耐OFLX菌株间观察到了类似的因单链构象变化而引起的单链位移的结果。结论PCR-SSCP合并Southern杂交可以清晰地区分对OFLX敏感与耐药的菌株，以100μg／m1为界作为判别结核分枝杆菌对OFLX是否已经产生耐药的标准是适宜的。     

结核分枝杆菌利福平依赖性的初步研究

目的 从耐利福平（RFP）结核分枝杆菌临床分离株中筛选RFP依赖的菌株,并在小鼠模型中验证RFP依赖现象,同时分析RFP依赖菌株的特征。 方法 采用7H11培养基绝对浓度法对46例临床分离菌株进行RFP依赖菌株筛选。以筛选得到的体外具有典型的RFP依赖现象的05116菌株建立气溶胶感染的小鼠模型,小鼠按照给药的种类和给药单位剂量分成对照组0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium,CMC）、10 mg/kg Rfb（Rfb₁₀）组、10 mg/kg RFP（RFP₁₀）组、20 mg/kgRFP（RFP₂₀）组,每组各10只,观察给药4、8周的体质量、肺荷菌量及组织病理学改变在各组之间差异,以验证小鼠体内是否存在RFP依赖现象。比较RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点,以鉴定RFP依赖株的特征。数据以(x±s)表示,采用SPSS 11.0软件,组间比较采用单因素方差分析,以 P<0.01为差异有统计学意义。 结果 从46例RFP耐药的结核分枝杆菌临床分离株中筛选到18例RFP耐药伴依赖的菌株和28例RFP耐药非依赖的菌株。感染小鼠模型给药8周,各组小鼠的活菌计数从高到低依次为：RFP₂₀组（lgCFU为6.60±0.82）、RFP₁₀组（lgCFU为6.44±0.36）、Rfb₁₀组（lgCFU为6.32±0.55）、对照组(lgCFU为6.20±0.28),接近于最初感染的菌量（lgCFU为5.93±0.14）,但与对照组相比差异无统计学意义（F值分别为0.68、2.21、2.45,各组P值均大于0.05）。RFP耐药株8例和依赖株11例,分别有3/8和4/11的菌株在rpoB基因526位发生突变,2/8和6/11的菌株在rpoB基因531位发生突变。 结论 RFP临床耐药株中RFP依赖菌的检出率高,其RFP依赖现象在小鼠体内得到初步验证。RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点基本相同,因此RFP依赖的原因是表型变异还是其他因素尚有待进一步的实验证实。     

结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究

目的　了解结核分枝杆菌喹诺酮 (quinolones)耐药株耐药基因突变情况,评价其应用价值。方法 通过 16SrRNA聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析 77株分枝杆菌临床分离株;通过PCR SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况。 结果 75株为结核分枝杆菌复合群。 30株喹诺酮敏感株的 gyrA基因的SSCP图谱中,11株与H₃₇R_v相同,19株与卡介苗相同;与卡介苗 gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株 95位密码子为ACC,与H₃₇R_v该图谱相同的敏感株 95位密码子为AGC。 45株喹诺酮耐药株中,34株 (75.6%) gyrA基因SSCP图谱泳动异常,对 25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实 15株 (44.1%)为 94位密码子GAC→GGC突变;10株 (29.4%)为 90位密码子GCG→GTG的突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyrA基因突变有关,PCR SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮH）分离株ＫａtG基因完全缺失或突变的情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。方法应用ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对５８株结核分支杆菌临床分离株的ＫａｔＧ基因进行分析。结果以Ｈ３７，ＲＶ标准株为对照，１２株敏感株的ＫａｔＧ基因扩增产物，１１株SSCP泳动正常，1株（８．３％）异常；２４株耐ＩＮＨ株中，３株（ｌ．５％）PCR扩增阴性，ＺＩ株ＫａtG扩增阳性，其中１６株（７６．２％）SSCP泳动异常；２２株耐其它抗结核药物株中，也有７株（３１．８％）SSCP异常。结论某些结核分支杆菌ＩＮＨ耐药性产生可能是由于其ＫａｔＧ基因完全缺失或ＫａｔＧ基因突变所致，但某些菌株也可能与ＫａｔＧ基因无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。     

广州市依赖药物结核分枝杆菌分离率的初步调研

目的 了解和分析广州市依赖药物结核分枝杆菌的分离率,为临床第一线治疗结核病提供科学依据。 方法 对临床分离出的3 911株经实验室鉴定确证为结核分枝杆菌,采用罗氏药敏方法对临床常用的11种药物（包括利福平R、异烟肼H、链霉素S、乙胺丁醇E、环丙沙星C、左氧氟沙星Lfx、硫酸阿米卡星Am、丙硫异烟胺Pto、莫西沙星Mfx、克拉霉素Clr、力克菲蒺D）进行结核分枝杆菌的药物依赖性测定。 结果 3 911株结核分枝杆菌中,有159例患者共分离出192株对上述11种药物中的其中10种有程度不同的药物依赖性,依赖药物分离率为4.9%（192/3 911）;其中依赖R分离率为 2.7%（104/3 911）、其次H 2.4%（92/3 911）、S 1.0%（38/3 911）、C 0.4%（16/3 911）、Lfx 0.3%（12/3 911）、Am 0.3%（10/3 911）、E 0.2%（8/3 911）和Pto 0.1%（5/3 911）以及Mfx、Clr各0.1%（3/3 911）;暂未见力克菲蒺有结核分枝杆菌依赖现象;在159例患者中,有25例为广泛耐多药结核（XDR-TB）患者,110例为耐多药结核（MDR-TB）患者,二者占依赖药物结核分枝杆菌感染的84.9%（135/159）。 结论 结核分枝杆菌对药物的依赖性,以R、H为主,对Mfx、Clr的依赖率最低;而依赖药物结核分枝杆菌感染患者中,绝大部分均为MDR-TB和XDR-TB患者,这是值得临床第一线关注的严重问题。     

青浦区552株结核分枝杆菌原发耐药性分析

目的了解青浦区1999年～2008年新登记肺结核患者的原发耐药情况。方法采用绝对浓度法对新发初治肺结核患者痰标本培养菌株进行链霉素（S）、异烟肼（H）、利福平（R）和乙胺丁醇（E）4种抗结核药物的耐药性测定，统计分析原发耐药情况。结果原发总耐药率由1999年～2000年的9．2％上升至2007年～2008年的15．5％；S、H、E的耐药率由1999年的5．0％、7．1％、2．8％上升至2008年的12．1％、13．8％、3．4％；R的耐药率由1999年的5．0％下降至2007年～2008年的4．3％；原发耐多药率（MDR．TB）平均为4．5％。2药、3药的耐药率分别由1999年的2．1％、0％上升至2008年的6．0％、1．8％。1药、4药的耐药率基本在同一水平。结论青浦区肺结核患者临床分离株原发耐药性成上升趋势，耐多药菌株仍占一定比例。     

应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法?方法 通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质?结果 以H37RV标准株为对照,13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点;37株耐SM分离株中,31株(838%)无MboⅡ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无MboⅡ酶切位点?结论 大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变?PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法?     

痰耐药结核分枝杆菌embB基因的快速检测及乙胺丁醇耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌embB基因及了解乙胺丁醇（EMB）耐药的分子机制。方法用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增embB基因片段,对扩增获得的embB基因片段进行序列测定,比较分析全耐、对EMB敏感的耐多药、对EMB耐药的耐多药、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6小时内从耐药肺结核痰中快速检测到embB基因。从所有临床分离菌株均扩增获得847bp片段,序列测定比较发现,全耐菌和对EMB耐药的耐多药菌株均检测有embB基因点突变,突变位点均为第306位密码子ATG突变为ACG,而全敏感株、对EMB敏感的耐多药菌株和标准菌株均未检测到基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌embB基因及其突变,结核分枝杆菌对EMB的耐药性与embB基因点突变有关。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中结核分枝杆菌-DNA（TB-DNA）对肺结核的诊断价值。方法肺结核52例（菌阳20例,菌阴32例）,肺炎35例,采用FQ—PCR法检测其支气管肺泡灌洗液中TB—DNA水平。结果52例肺结核组的阳性率为65．4％（菌阳19例,菌阴15例）,35例非肺结核组的阳性率为5．7％,经统计学比较,FQ-PCR法检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和培养法（P均〈0．05）,FQ-PCR法特异性高。结论FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。     

不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较

目的 建立简便有效的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）总RNA提取方法。 方法 采用5种方法,分别为160、240和400 W超声波联合Trizol法（简称“160 W超声法”、“240 W超声法”和“400 W超声法”）、玻璃珠（简称“玻珠”）联合Trizol法（简称“玻珠法”）和Trizol法（简称“不加玻珠法”）,对结核分枝杆菌标准株H37Rv进行破壁,提取总RNA。通过荧光定量逆转录PCR评价不同破壁方法对Mtb总RNA提取效果的影响,以灭菌超纯水代替模板为阴性对照。每种方法分别提取3份样本进行检测。最后结果为3份标本的平均值。 结果 玻珠法检测组Ct值为20.67,△Rn值为0.644;400 W超声法检测组Ct值为22.09,△Rn值为0.571;240 W超声法检测组Ct值为21.86,△Rn值为0.503;160 W超声法检测组Ct值为25.21,△Rn值为0.411;不加玻珠法检测组Ct值为28.40,△Rn值为0.299;阴性对照Ct值为40.00,△Rn值为0.000。 结论 直观地从试验结果来看,玻珠法对结核分枝杆菌破壁效果好于超声法。     

耐利福平肺结核病人的治疗观察

目的探讨含二线药物治疗方案的有效性和安全性。方法采用多中心、随机分组方法,将耐药结核病监测中发现的耐药肺结核（至少耐利福平）患者154例,随机分入观察组和对照组,采取不同化疗方案治疗。观察组以二线抗结核药物为主;对照组则为国家结核病控制规划制订的复治方案,均为一线抗结核药物。以细菌学和影像学改变作为疗效评价标准。结果(1)114例完成全程治疗,40例患者退出研究,其中对照组26例,观察组14例（P>0.05）;(2) 细菌学改变：观察组痰菌转阴率为81.7%,对照组为70.0%（P>0.05）。在病变范围较小者中,观察组和对照组痰菌转阴率分别为90.3%、90.0％（P>0.05）,在病变范围较大者中,观察组和对照组痰菌转阴率分别为77.5%、52.2％（P<0.05）。(3)影像学改变：2组X线胸片病灶吸收差异无统计学意义。(4) 安全性：观察组和对照组中发生不良反应的分别有17例、8例（P>0.05）。结论对于初治的耐药肺结核患者,以及病变较广泛的耐药肺结核患者,采用含二线药物的治疗方案同样安全,但疗效可能更好。