角膜基质细胞条件培养液促进角膜内皮细胞增生的研究

目的 探讨人胚胎角膜基质细胞(human embryonic C01Tleal stromal cells,hECSC)条件培养液对人胚胎角膜内皮细胞(human embryonic corneal endothelial cells,hECEC)体外增生的影响.方法 将生长融合达80%的原代hECEC用0.125 g·L-1胰蛋白酶/0.53 mmol·L-1EDTA传代5～10 min,第1代分3组接种于96孔板,第2天分别加入DMEM/F12(含体积分数10%FBS)、DMEM/F12(含体积分数15%FBS)和hECSC条件培养液;MTT法检测细胞增生情况;免疫荧光法对hECEC进行初步鉴定;BCA蛋白定量试剂盒检测hECSC条件培养液中蛋白含量;SPSS 11.5软件包对数据进行统计学分析.结果 MTT法检测DMEM/F12含10%FBS、DMEM/F12含15%FBS和hECSC条件培养液培养的A值分别为0.111 67±0.004 10、0.110 13±0.003 17、0.122 53±0.004 10,多组方差分析显示,条件培养液组与其他2组相比差异均有统计学意义(P均<0.05);免疫荧光结果显示hECSC呈NSE和ZO-1阳性染色;BCA蛋白定量结果显示hECSC条件培养液中总蛋白浓度为871.385 mg·L-1.结论 hECSC条件培养液对hECEC的体外生长增生有促进作用,其应用和其中活性成分分析有待进一步的研究.     

EDTA对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的 观察不同浓度的EDTA对免角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)增殖的影响.方法 采取揭取角膜后弹力层联合酶消化法分离培养兔CECs;分别用0.5 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1的EDTA作用于体外培养的免CECs 1h然后于24 h、48 h、72 h、96 h观察不同浓度的EDTA对免CECs的影响.采用CCK-8检测方法测定在450 nm处各吸光度(A值)来判断CECs的增殖状况采用流式细胞检测仪对各组细胞周期进行检测同时采用倒置显微镜观察细胞形态的变化.结果 揭取带内皮细胞的后弹力层联合酶消化法培养的兔CECs可很快贴壁、增殖,并在4～5 d融合为单层 CCK-8检测结果显示0.5 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1的EDTA作用后各个时间点均能使CECs的吸光度发生改变,同一时间点0.5 mmol·L-1的EDTA对细胞增殖的作用最为显著,各摩尔浓度的EDTA对兔CECs作用后96h吸光度改变最明显(A值分别为:2.595 2±0.053 0、2.090 4±0.159 2、0.939 1±0.077 2).作用48 h后0.5mmol·L-1组兔CECs的S+C2/M期细胞所占比例(A值为1.292 5±0.018 3)与阴性对照组比较,差异有统计学意义,而2.5mmol·L-1、5.0 mmol·L-1组与阴性对照组(A值为0.921 2±0.084 8)比较,差异均无统计学意义.结论 0.5 mmol·L-1的EDTA作用于兔CECs 1 h后的不同时间均有明显的促进增殖的作用.     

吡非尼酮对大鼠角膜基质细胞增殖的影响

目的：：探讨吡非尼酮( Pirfenidone,PFD)对体外培养大鼠角膜基质细胞增殖的抑制效果及其对转化生长因子-β1( transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响。方法：分离培养大鼠角膜基质细胞,根据PFD用药的不同浓度分为对照组(0mg/mL)、实验组Ⅰ(0.15mg/mL)、实验组Ⅱ(0.3mg/mL)、实验组Ⅲ(1mg/mL),加药48h后应用CCK-8法检测其对角膜基质细胞增殖能力的影响,免疫细胞化学和Western-blot分别检测ki-67和TGF-β1表达的变化。结果：CCK-8结果显示,相比对照组,各实验组对角膜基质细胞的增殖均有明显的抑制作用,且随浓度的增大其抑制作用明显增强(均P<0.05);免疫细胞化学显示PFD能明显降低ki-67阳性指数( P<0.05);Western-blot结果显示,PFD能降低TGF-β1的表达,且呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论：PFD对大鼠角膜基质细胞的增殖具有明显抑制作用,抑制机制与下调TGF-β1表达密切相关,在减轻角膜创伤愈合方面具有潜在的运用前景。     

富血小板血浆促猫角膜内皮细胞增殖的研究

目的 观察富血小板血浆对体外培养猫角膜内皮细胞增殖的影响.方法 采用揭膜法与消化法相结合获取猫角膜原代内皮细胞,培养基采用DMEM培养基(含体积分数10％胎牛血清).采用二次离心法提取富血小板血浆.在完全培养基中加入体积分数分别为5％、10％、20％的富血小板血浆培养角膜内皮细胞,以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照.CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,扫描电镜观察细胞形态变化.结果 富血小板血浆体外培养角膜内皮细胞时间越长,其促增殖作用越明显,与对照组比较差异均有显著统计学意义意义(均为P ＜0.01),且随着富血小板血浆含量的增加,角膜内皮细胞增殖越明显,呈剂量依赖性.扫描电镜检测表明,与对照组相比,PRP作用组角膜内皮细胞表面可见丰富的微绒毛,且随着富血小板血浆含量的增加,微绒毛越丰富.结论 富血小板血浆能明显促进体外培养猫角膜内皮细胞增殖.     

低强度氦-氖激光对体外培养的兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的探讨不同条件低强度氯氖激光照射对体外培养的兔角膜内皮细胞增生的影响。方法体外培养的兔角膜内皮细胞经低强度激光照射后，MTT比色法检测其增生活性；通过生物显微镜、组织化学染色观察其照射前后形态学变化；通过流式细胞仪检测其照射前后细胞周期的变化等。结果MTT检测结果显示，体外培养的兔角膜内皮细胞经低强度激光照射后，其增生活性提高，本实验中最适照射强度和时间分别是5mW·cm^-2、600s；流式细胞仪细胞周期检测结果显示：激光照射组的细胞增生指数明显高于对照组，而与碱性成纤维细胞生长因子组比较差别无显著性意义。结论低强度激光在一定程度上可促进角膜内皮细胞的增生。     

人骨髓内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的探讨人骨髓内皮祖细胞的特性及其替代角膜内皮细胞成为种子细胞的可行性。设计实验研究。研究对象人骨髓内皮祖细胞。方法利用密度梯度离心法从人骨髓中分离出单核细胞,接种到纤维蛋白铺层和明胶铺层的培养皿中,EGM-2培养液培养,比较这两种不同铺层对细胞生长增殖的影响。检测人骨髓内皮祖细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素能力,免疫荧光检测CD133和CD34,RT-PCR检测Ⅷ型胶原表达情况。主要指标人骨髓内皮祖细胞形态特点,免疫荧光、RT-PCR结果。结果人骨髓内皮祖细胞呈短梭形或多边形,纤维蛋白铺层较合适。人骨髓内皮祖细胞能摄取ACLDL,结合UEA-1,表达CD133和CD34,表达角膜内皮细胞较特异的Ⅷ型胶原。结论人骨髓内皮祖细胞有望成为较理想的代替角膜内皮细胞的种子细胞。     

神经生长因子对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的 探讨神经生长因子（NGF）对角膜内皮细胞增殖的影响。方法 在培养兔角膜内皮细胞的培养液中分别添加5U／ml,50U／ml和500u/ml的NGF,加药后第3,7天采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法,在酶标仪上测定570nm波长处的吸光度值来观测细胞增殖情况。结果 与对照组比较,加药后第3,7天,3组的NGF对培养的兔角膜内皮细胞增殖均促进作用（P＜0．01）,且呈剂量依赖性。其中50U／ml组及500U／ml组作用强于5U／ml（P＜0．05）,而50U／ml组和500U／ml组比较作用无差异（P＞0．05）。结论 外源性NGF对培养的兔角膜内皮细胞增殖有明显的促进作用。     

Effects of ranibizumab on human corneal endothelial cells

PurposeThis study aims to evaluate corneal endothelial changes occurring over a 3-month period after intravitreal injections of ranibizumab in patients with wet age-related macular degeneration.MethodsThis is a prospective case series. A total of 29 patients (29 eyes) received a 0.5-mg intravitreal injection of ranibizumab. Specular microscopy, including measurement of central corneal thickness and endothelial cell count, was performed on each patient prior to and after completing three intravitreal injections.ResultsAll patients received three intravitreal injections and were followed up for a mean of 3 months. There was no significant change in corneal thickness (p = 0.32) or endothelial cell density (p = 0.38) after ranibizumab injections.ConclusionIntravitreal ranibizumab injections (0.5 mg) have no harmful effects on corneal endothelial cells.     

波动的压力对兔角膜内皮细胞的影响

目的　观察波动的压力对角膜内皮细胞的影响。方法　将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞分为两组:Ａ组为压力波动组（压力设置为:１５ｍｍＨｇ～２５ｍｍＨｇ～２０ｍｍＨｇ～１０ｍｍＨｇ,每个压力持续６ｈ;１ｋＰａ＝７．５ｍｍＨｇ）;Ｂ组为３０ｍｍＨｇ压力组;Ｃ组为无压力组。三组细胞分别培养２４ｈ。免疫细胞化学染色法鉴定原代角膜内皮细胞形态;台盼蓝-茜素红联合染色检测细胞活性,ＨＥ染色观察细胞形态;Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测细胞中Ｂｃｌ-２和Ｐ５３蛋白的表达水平。结果　获取的所有细胞证实为角膜内皮细胞表型,无角膜上皮细胞及基质细胞污染。三组细胞分别培养２４ｈ后,经台盼蓝-茜素红染色和ＨＥ染色证实:两个压力培养组的细胞活性较无压力培养组明显下降,其中压力波动组的细胞活性低于３０ｍｍＨｇ压力组。同时无压力组、３０ｍｍＨｇ压力组和压力波动组细胞中Ｐ５３蛋白的相对表达量分别为０．１５０±０．００５、０．２５３±０．０１４、０．６７０±０．０１９,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　证实了高压力及非生理性波动的压力对角膜内皮细胞均具有损伤作用。     

角膜内皮细胞体外增生、培养和鉴定

角膜内皮细胞对维持角膜透明和脱水状态具有重要作用,体外成功培养对研究角膜内皮细胞的结构和功能具有重要意义,也是角膜组织工程开展的基础工作之一。但是角膜内皮细胞体外培养受其增生能力、培养条件和细胞鉴定等多种因素限制,成为角膜生物学及角膜组织工程的研究热点,本文就角膜内皮细胞体外增生、培养和鉴定的研究进展进行综述。     

角膜基质细胞—PGA生物支架复合体外培养研究

目的 研究角膜基质细胞与PGA亲和力,为组织工程技术建构角膜提供重要的理论依据和参数。方法 体外分离获得角膜基质细胞,经培养扩增后接种于PGA,并对细胞－生物材料复合物进行体外培养,观察细胞生长代谢。应用MTT技术测定角膜基质细胞与PGA的黏附率。结果 角膜基质细胞能够在PGA中黏附、伸展和分泌基质,MTT测得细胞黏附率为71．40％。结论 角膜基质细胞与PGA具有较好的亲和力,PGA可以作为构建角膜的生物材料。     

房水对培养的角膜基质细胞的影响

目的观察房水对角膜基质细胞生长的作用。方法将新西兰大白兔的角膜去除后弹力层、内皮层和上皮层后,得到基质层,用组织块培养法体外培养角膜基质细胞。在实验组的培养基中加入10％房水,对照组使用常规培养基培养。通过CCK8实验测得角膜基质细胞的吸光度（A）值以分析细胞增生的情况。分别在培养基中加入2．5％、5％、10％、15％、20％的房水,用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。结果倒置显微镜观察可见培养的角膜基质细胞呈多角形或树枝状,与对照组相比,实验组的细胞生长状态良好,培养的角膜基质细胞数量明显增加。明胶酶谱法显示实验组的条带比对照组清晰。实验第1～5天分别测角膜基质细胞的A值,实验组的检测条带明显强于对照组,〉10％的房水培养组检测的条带明显强于2．5％、5％房水培养组。CCK8检测表明,培养1～5d实验组的角膜基质细胞A值明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论房水作用于角膜基质细胞后,可促进角膜基质细胞的生长,10％房水对体外培养角膜细胞有促细胞增生的作用。     

玻璃体手术方式对角膜内皮细胞的影响

目的:探讨不同的玻璃体手术方式对角膜内皮细胞计数的影响,提示硅油取出的最佳时机。方法:根据手术方式及硅油填充情况,对符合本研究条件37例40眼的玻璃体视网膜疾病患者进行分组,分别为单纯玻璃体切割术组(A组)、玻璃体切割联合硅油填充术组(B组)及玻璃体与晶状体切割联合硅油填充术组(C组)。用角膜内皮镜分别测量这三组病例术前1d和术后1wk;1,3,6mo的角膜内皮细胞计数,比较手术前后以及同一时期不同组间角膜内皮细胞计数的变化。结果:三组病例术后1wk及1mo的角膜内皮细胞计数较术前相比无统计学上的差异;单纯玻璃体切割术组术后3,6mo的角膜内皮细胞计数较术前相比亦无统计学上的差异;玻璃体切割联合硅油填充术组术后3mo的角膜内皮细胞计数较术前相比无统计学上的差异,而术后6mo的角膜内皮细胞计数较术前相比明显减少,在统计学上有差异;玻璃体与晶状体切割联合硅油填充术组术后3,6mo的角膜内皮细胞计数较手术前明显减少,统计学上有差异。结论:在眼压控制良好的情况下,有晶状体眼行玻璃体切割硅油填充术后6mo角膜内皮细胞计数明显减少;而无晶状体眼行玻璃体切割硅油填充术后3mo时角膜内皮细胞计数即显著减少。这一结果说明玻璃体腔内硅油填充能够明显减少角膜内皮细胞数,而我们在玻璃体切割硅油填充术组保留了晶状体,这时我们观察玻璃体腔中硅油填充6mo时角膜内皮细胞计数才明显减少,表明晶状体的存留对于角膜内皮的保护具有积极的意义。     

人表皮生长因子对体外培养兔角膜内皮细胞影响的实验研究

目的：明确人表皮生长因子（ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ,ｈＥＧＦ）对角膜内皮细胞的影响。方法：采用体外培养的兔角膜内皮细胞,观察接种后不同时点ｈＥＧＦ对其生长状态的影响;兔角膜片内皮损伤模型,离体培养后行Ｈ－Ｅ染色和Ｈ＾３－ＴｄＲ掺入放射自显影,观察ｈＥＧＦ对其修复的影响。结果：兔角膜内皮细胞体外培养ｈＥＧＦ组细胞数高于对照组,并使细胞形态产生纺锤形改变;角膜内皮细胞     

小鼠胚胎干细胞条件培养基体外促进人角膜内皮细胞增殖的研究

目的　观察小鼠胚胎干细胞条件培养基（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ,ＥＳＣ-ＣＭ）是否可以在体外促进人角膜内皮细胞（ｈｕｍａｎｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＣＥＣｓ）的增殖。方法　利用角膜内皮后弹力层组织块方法进行原代培养Ｐ０ＨＣＥＣｓ。实验组使用含有２５％ＥＳＣ-ＣＭ的培养液进行培养,对照组使用普通角膜内皮细胞培养液（ｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｍｅｄｉ-ｕｍ,ＣＥＭ）进行培养。倒置相差显微镜、反转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ-ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ-ＰＣＲ）鉴定ＨＣＥＣｓ;倒置相差显微镜观察细胞的形态及萌出时间;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、免疫组织化学法观察ＨＣＥＣｓ的泵相关功能蛋白（ｚｏｎａｏｃｃｌｕ-ｄｅｎｓｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＺＯ-１）及Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶的表达。Ｇｉｅｍｓａ染色细胞克隆实验、免疫组织化学及流式细胞学检测Ｋｉ６７阳性率的方法比较ＨＣＥＣｓ的增殖能力;流式细胞学方法检查细胞周期及细胞凋亡情况。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和免疫组织化学方法检测细胞周期负性调节蛋白Ｐ２１的水平,初步探讨其可能的作用机制。结果　原代培养时,２５％ＥＳＣ-ＣＭ组培养的ＨＣＥＣｓＰ２细胞爬出,细胞形态呈典型多角形结构。ＣＥＭ在Ｐ２时细胞形态变大,失去了多角形结构。２５％ＥＳＣ-ＣＭ 组和ＣＥＭ组均表达ＺＯ-１、Ｎａ＋-Ｋ＋-ＡＴＰ酶。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的Ｋｉ６７阳性率、克隆形成数量、进入到细胞周期Ｓ期和Ｇ２期的比例均高于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。２５％ＥＳＣ-ＣＭ组的细胞凋亡数量和Ｐ２１阳性率均低于ＣＥＭ组（均为Ｐ＜０．０５）。结论　２５％ＥＳＣ-ＣＭ组可显著促进ＨＣＥＣｓ增殖;其作用可能是通过抑制Ｐ２１蛋白的表达和抑制细胞凋亡实现的,为ＨＣＥＣｓ体外大量扩增提供了一种新方法。     

各种因素对角膜内皮细胞形态的影响

角膜内皮细胞的研究早在19世纪就开始了,近年来各种新设备和技术的应用使人们对角膜内皮损伤的进一步研究成为可能,对角膜内皮损伤的病理、愈合的过程、修复机制也有了更深刻的认识。很多疾病、手术、外伤、药物、激光以及先天性疾病等都可以对角膜细胞产生很大的影响。它们可以引起角膜内皮细胞水肿、细胞数量减少、多形性变化。     

角膜内皮细胞对丝裂原刺激的淋巴细胞活化和增殖的抑制作用

目的观察角膜内皮细胞（ＣＥＣ）对淋巴细胞活化和增殖的抑制活性,并分析其机制。方法通过植片技术分离大鼠和兔ＣＥＣ。在ＣＥＣ单层上,观察淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）和同种异体抗原刺激的增殖反应。另外,将ＣＥＣ培养上清直接转移到由ＣｏｎＡ刺激的淋巴细胞增殖系统以观察ＣＥＣ释放某些因子的抑制效应。结果ＣＥＣ对ＣｏｎＡ或同种异体抗原刺激的淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。在这些检测系统中所观察到的抑制效应不具有ＭＨＣ限制性。将ＣＥＣ培养上清直接转移到由ＣｏｎＡ刺激的淋巴细胞增殖系统,并未观察到显著的抑制效应。然而,当ＣＥＣ培养上清经过浓缩和酸处理后,则在胸腺细胞共刺激实验中显示剂量－反应形式的抑制效应。结论ＣＥＣ通过细胞交互作用和（或）释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。ＣＥＣ可能是构成眼前房免疫赦免的因素之一。     

Effects of ambient oxygen concentration on the proliferation and viability of cultured human corneal epithelial cells

Ambient oxygen (O(2)) affects the metabolism and other functions of corneal epithelial cells. The effects of O(2) concentration on the proliferation and viability of corneal epithelial cells in culture were investigated. Simian virus 40-transformed human corneal epithelial (HCE) cells were maintained at 37 degrees C in a humidified incubator containing 5% CO(2) and 95% air. The cells were subsequently transferred to a multigas incubator and exposed to 5% CO(2) and either 1, 21, or 60% O(2) plus 94, 74, or 35% N(2), respectively. Cell proliferation was evaluated by determination of cell number and measurement of the incorporation of bromodeoxyuridine. Cell lysis was quantified by measurement of the release of lactate dehydrogenase. Apoptosis was evaluated by flow cytometric analysis of cells stained with annexin V and propidium iodide as well as by immunoblot analysis of cleavage of caspase-7. The phosphorylation (activation) of Akt was also detected by immunoblot analysis. Hyperoxia (60% O(2)) inhibited the increase in cell number and the incorporation of bromodeoxyuridine apparent in HCE cells exposed to normoxia (21% O(2)). It also induced the release of lactate dehydrogenase, an increase in the proportion of apoptotic (annexin V(+), propidium iodide(-)) cells, the cleavage of caspase-7, and the phosphorylation of Akt. None of these effects was observed in cells exposed to hypoxia (1% O(2)). The amounts of the cleaved forms of caspase-3, 6, and 9 did not differ among HCE cells cultured under 1, 21, or 60% O(2). These results indicate that hyperoxia inhibited the proliferation of, and induced death by apoptosis in, cultured human corneal epithelial cells. The antiapoptotic protein Akt was also activated in cells exposed to hyperoxia, possibly reflecting a protective response to oxygen toxicity.     

低密度角膜内皮细胞白内障的超声乳化术效果分析

目的评价超声乳化治疗低密度角膜内皮细胞白内障的安全性及临床效果。方法低密度角膜内皮细胞（〈1500／mm^2）的白内障22例（26眼）,其中伴青光眼者8例（10眼）,伴眼前段炎症者5例（5眼）,玻璃体切除术后4例（4眼）。进行超声乳化吸出联合人工晶状体植人手术,观察术后视力及角膜水肿的情况。结果术后视力均有不同程度的提高。最佳矫正视力0．1～0．3者8眼,〉0．3者18眼。术后第1天角膜水肿≤I级者11眼,Ⅱ级者10眼,Ⅲ级者5眼。无角膜失代偿者。结论随着人工晶状体的改善和手术技巧的提高,低密度角膜内皮细胞的白内障可以行超声乳化吸出及人工晶状体植入术。     

肝细胞生长因子对牛视网膜血管内皮细胞的促增生移行效应

目的 体外培养牛视网膜血管内皮细胞（BREC），观察肝细胞生长因子（HGF）对其促增生和移行效应。方法通过FⅧr-Ab免疫组织化学法鉴定培养的BREC；向BREC中加入不同质量浓度的HGF，4d后用MTT法测定细胞增生情况；向有正方形无细胞区的6孔培养板中加入不同质量浓度的HGF，24h后计数进入空白区的细胞，判定细胞移行效应；流式细胞仪测增生周期。结果HGF对BREC促增生成剂量一时间依赖关系，在不同质量浓度下增生率分别为8．5％，12．4％，33．8％，39．8％。25ng／ml HGF作用1～4d，增生率分别为4．5％，8．3％，10．4％，15．6％。HGF对BREC促移行呈质量浓度依赖关系，移行能力分别为10％，63％，239％，476％。流式细胞仪结果显示HGF促BREC增生主要作用于细胞周期的M期。结论HGF可显著促进BREC的增生和移行，是细胞的有丝分裂原和强有力的促移行因子。