重组TRX-BNP融合蛋白的构建和表达

目的:构建人B型钠尿肽(BNP)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原TRX-BNP融合蛋白.方法:根据GenBank中检索到的人BNP成熟蛋白序列编码,设计合成编码BNP-32蛋白的DNA,并分别在5'端和3'端设计EcoR I和HindⅢ酶切位点,经聚合酶链反应(PCR)、构建重组质粒pET32a.BNP,并在BL21(DE3)经IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和层析制备TRX-BNP.通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-BNP质粒及表达的BNP抗原的正确性.结果:DNA测序结果表明,所获得的BNP基因编码序列符合序列设计的要求,正确插入设计位点,重组质粒pET32a.BNP构建成功.IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示有特异性蛋白TRX-BNP表达,蛋白相对分子质量21 400,Ni-NTA亲和纯化,在UVP凝胶成像分析系统上作定量分析,BNP蛋白纯度达到95%.Western印迹结果证实TRX-BNP蛋白特异性表达.结论:成功制备TRX-BNP融合蛋白.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ

目的 利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ.方法 采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CA Ⅸ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a( )表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Western blot鉴定.结果 正确构建pET32a( )/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58 000相对分子质量处有明确的条带.目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%.89.9%的重组蛋白是可溶性的.Western blot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合.结论 在原核系统中成功进行G250/MN/CAⅨ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达

目的：构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21（DE3）中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果：酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a／rmcAg,SDS—PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64．3％。结论：应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定

目的获取大鼠内皮抑索的cDNA片断，并构建融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT—PCR法从中扩增内皮抑素基因。并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的克隆与表达

目的 克隆并表达十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂（Aa—API-1）。方法根据犬钩虫及锡兰钩虫API保守序列设计引物,RT—PCR扩增获得Ad—API-1完整阅读框序列,并将Ad—API—1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,以构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌B121（DE3）中用IPTG诱导表达,用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得Ad—API-1完整阅读框序列;构建了pET32a／Ad—API-1重组质粒,Ad—API—1在大肠杆菌中得到了高效表达。结论成功克隆并表达Ad—API—1,为进一步研究Ad—API-1的功能,探讨其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础。     

TAT—GluR6—9C与pMON原核表达载体重组体的构建

目的表达和纯化TAT—GluR6—9C小肽,用于脑缺血细胞信号转导的研究。方法用化学合成的方法获得TAT—GluR6—9C小肽的cDNA;与原核表达载体pMON用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JMl09进行筛选、序列测定。结果①经化学合成并退火得到了TAT—GluR6—9C的双链cDNA;②酶切鉴定能观察到TAT—GluR6—9C和pMON两条带;③TAT—GluR6—9C测序图谱与GenBank报道完全一致。结论获得了含目的基因TAT—GluR6—9C的pMON原核表达载体重组体。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

广州地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因序列分析

目的：探讨广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因变异的生物学意义，为研究广州地区BSV感染特点及RSV疫苗提供依据。方法：用PT—PCR的方法从广州地区呼吸道合胞病毒分离株98159株的细胞培养物中扩增出编码其表面蛋白G的基因片段，克隆至pGEM—T载体中并进行序列测定。结果：序列测定结果与A亚型原型株A2抹、1990年中国北京地区分离株B79G蛋白的核苷酸序列比较核苷酸同源率分别为92．7％及98．4％；由核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源率分别为88.3％及97．0％。一些重要的免疫反应位点发生了变异。结论：RSVG蛋白抗原结构变异大，在研制疫苗时应注意选用株的地区性。     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。