细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化

目的从我国细粒棘球绦虫分离株（新疆源和甘肃源）中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察。方法设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a（＋）、pET32a（＋）和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较。结果从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致。在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响。结论成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体。     

细粒棘球绦虫重组pCD-Eg95质粒构建及鉴定

目的:构建并鉴定细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)重组pCD-Eg95质粒.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pCDNA3.1中构建pCD-Eg95重组质粒;电穿孔转化大肠杆菌BIA21(DE3)株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.结果:电泳及测序证实471 bpEg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pCD-Eg95成功转入BL21(DE3).结论:成功构建了Eg重组pCD-Eg95质粒.     

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

细粒棘球蚴AgB亚单位基因的联合表达和血清学评价

目的为进一步提高AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性,将细粒棘球蚴AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达,并对联合表达的重组抗原和单基因表达的AgB1、AgB2在血清抗体检测中的差异进行比较研究。方法在表达载体PET32a中构建AgB1+AgB2(AgBs)联合基因的重组质粒,用ELISA检测重组抗原与病人血清的反应性。结果构建了AgBs重组质粒,经测序证实插入的联合基因片段序列正确。AgBs重组质粒表达的融合蛋白分子量为38kDa,为不溶性蛋白。联合表达抗原AgBs对细粒棘球蚴病(CE)血清的敏感性为84.4%,特异性为80.5%;单基因表达的AgB1和AgB2的敏感性分别为75.6%和57.8%,特异性分别为72.6%和91.2%。结论成功构建了AgB亚单位联合表达基因,联合表达的AgBs抗原对CE血清的诊断价值优于单基因表达的AgB1或AgB2抗原。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42 500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

细粒棘球绦虫66 kDa抗原的超微结构定位

目的：确定细粒棘球绦虫66kDa抗原在虫体组织超微结构中的精确定位。方法：本实验采用金标免疫组织化学方法，电镜观察66kDa抗原在细粒棘球绦虫原头蚴及成虫超薄切片中的定位。结果：该抗原定位于细粒棘球绦虫原头蚴及成虫虫体的体表、微毛内外、皮层、皮层合体细胞体(核周体)内和皮下肌纤维中。结论：该抗原可能由皮层合体细胞产生。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆抗原和分泌抗原２ｍｌ，加完全佐剂和不完全佐剂，免疫犬２次，每次间隔２１天，可使犬获得不完全抗攻击感染的能力。匀浆抗原的免疫优于分泌抗原，感染率为２５％，与对照组９０％比有显著差异，并对体现人虫体的发育有明显抑制作用，孕卵率为０；分泌抗原的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大，经抗原蛋白组份分析，原头匀浆抗原显示１４条蛋白组份，分别为２２．５、３１．０、３６．０、４０．０     

细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究

目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化At(LBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.用IPTG分别诱导rAt 0、1、3、5、7、9、11和13h.用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质.结果:471bp Eg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入At(LBA4404).用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5 kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%.结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在At(LBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

用EgAgB8/3重组蛋白ELISA-双抗夹心法建立棘球绦虫感染犬粪抗原检测系统的研究

目的高纯度表达细粒棘球绦虫抗原B(EgAgB8/3)重组蛋白,制备抗EgAgB8/3重组蛋白的多克隆抗体,建立ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪EgAgB8/3天然抗原系统。方法对已构建好的pET32a-EgAgB8/3-E.coli BL21(DE3)Lys S原核细胞表达系统进行IPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。目的蛋白用His-Binding-resin纯化柱进行纯化并免疫动物,免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化,一部分总IgG用过碘酸钠法进行标记,另一部分作为固相载体结合抗体备用。以未标记的总IgG为ELSA-双抗夹心法的包被抗体,细粒棘球绦虫感染犬粪粗提蛋白为夹心抗原,以标记的IgG为最终底物。结果成功获得高纯度EgAgB8/3重组蛋白和高效价多克隆抗体,运用标记和非标记IgG建立的ELSA-双抗夹心法对棘球绦虫感染犬粪特异性抗原检测的敏感性和特异性分别为85.0%和95.7%。结论获得的EgAgB8/3重组蛋白具有较好的免疫原性,且免疫动物后制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。用EgAgB8/3重组蛋白EL-SA-双抗夹心法粪抗原检测系统的成功建立为棘球绦虫感染犬快速诊断试剂盒的制备提供了科学依据,此方法的稳定性和推广实用性将需用大量的流行病学调查资料进一步证实。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性研究

目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值.方法:ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2wk皮下免疫1次,在第3次免疫后2wk,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20wk剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果:与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为96.6%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG,IgG1,IgG2a和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05).结论:细粒棘球绦虫诊断抗原P-29重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子.     

棘球蚴抗原B对小鼠1型糖尿病拮抗作用研究

目的:探讨细粒棘球蚴抗原B对小鼠1型糖尿病的拮抗作用及其机制。方法:30只雄BALB/c小鼠随机分为三组:肌内注射细粒棘球蚴抗原B加糖尿病成模组(A组,10只);肌内注射生理盐水加糖尿病成模组(B组,10只);对照组(C组,10只)。A组给予细粒棘球蚴抗原B,B组给予相同剂量的生理盐水,均为连续5 d,随后A组、B组均给予小剂量链脲佐菌素诱导1型糖尿病,C组未予任何处理。动态观察血糖变化,至3周末剖杀小鼠,留取血清,取胰腺组织切片HE染色,进行胰岛炎评分,用ELISA测定血清白介素-2(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:给药后,小鼠血糖逐渐升高,分别在第3天、成模后1周、成模后2周及成模后3周,B组血糖水平分别显著高于A组和C组(P<0.05);A组胰岛可见淋巴细胞浸润不多,而B组胰岛可见较多淋巴细胞浸润;糖尿病模型建立3周末,A组小鼠血清IL-4水平高于B组和C组,差异有统计学意义(P<0.05),A组小鼠血清IFN-γ水平低于B组(P<0.05)。结论:细粒棘球蚴抗原B对小鼠实验性1型糖尿病具有拮抗和保护作用,其机制可能与Th1/Th2免疫偏移有关。     

胆汁对小鼠细粒棘球蚴囊肿生长的影响

目的：探讨胆汁对细粒棘球蚴囊肿生长的影响。方法：实验组腹腔接种经胆汁处理20分钟后的原头蚴,对照组接种生理盐水处理的原头蚴,3月后按囊湿重、常规病理切片进行评价。结果：实验组和对照组囊湿重分别为11.94±6.56mg,23.06±3.02mg,差异有显著性（P〈0.01）;囊肿病理损害程度无差异（P〉0.05）。结论：胆汁短时间内不能直接杀灭包虫原头蚴,但是可以抑制包虫的囊肿生长。     

人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

目的建立PCR—RAPD反应体系,提升细粒棘球蚴随机扩增多态性DNA（RAPD）遗传多态性研究的稳定性,为研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。方法采用改进的酚-氯仿抽提法提取细粒棘球蚴基因组DNA,用单因素筛选方法建立PCR—RAPD分析体系。结果采用改进的酚／氯仿抽提方法提取细粒棘球蚴基因组DNA质量高,适用于PCR—RAPD扩增分析;在25μL体系中,RAPD—PCR扩增反应各成分的最佳浓度为：dNTP0．2—0．3mmol／L、Taq酶2．5U、随机引物0．8—1．4μmol／L,模板为60ng。PCR扩增最佳条件为：95℃预变性5min;94℃变性30s、32℃退火45s、72℃延伸1min、共35个循环;最后72℃延伸10min;初步从20条引物中筛选出11条带型丰富的随机引物。结论酚-氯仿适用于提取细粒棘球蚴基因组DNA,优化的RAPD反应体系和筛选出的随机引物适合进行细粒棘球蚴RAPD遗传多态性分析。