定量RT—PCR检测穿孔素mRNA方法的建立与临床初步应用

目的　建立检测穿孔素mRNA的定量RT PCR方法。方法　用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量RT PCR方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果　 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道肿瘤患者的穿孔素mRNA水平与正常相比 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ,乳腺肿瘤及白血病患者的穿孔素mRNA水平与正常人相比 ,没有差异。结论　穿孔素mRNA水平的降低可能是肿瘤发生的一个重要原因 ;除穿孔素途径以外 ,还存在别的抗肿瘤的效应机制。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测β地中海贫血患者β与γ珠蛋白mRNA表达水平

实时荧光定量ＰＣＲ方法 (ＦＱ ＰＣＲ)克服了已有的定量ＰＣＲ方法的缺点 ,特异性强 ,定量准确[1] 。我们应用实时荧光定量ＲＴ ＰＣＲ(ＦＱ ＲＴ ＰＣＲ)方法对 β地中海贫血 (β地贫 )患者 β与γ珠蛋白ｍＲＮＡ水平进行检测 ,现将结果报告如下。对象和方法1　对象1.1　β地贫患者 :2 7例 ,来源于广西医科大学第一附属医院门诊及住院患者 ,其中重型 β地贫 17例 ,男 8例 ,女 9例 ,中位年龄 1岁 6个月 ;轻型 β地贫 10例 ,男 4例 ,女 6例 ,中位年龄 2 8岁。所有病例均符合文献 [2 ]诊断标准。1.2　正常对照组 :2 5名 ,男 13名 ,女 12名 ,…     

RT—PCR检测外周血中肝癌细胞的研究进展

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测外周血中肝癌细胞是近年发展起来的新方法,白蛋白ｍＲＮＡ和ＡＦＰｍＲＮＡ为肝组织特异表达,通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血的标记,有助于判断肝癌的转移,复发。本文综述了近年有关这方面的研究进展。     

RT—PCR检测外周血中肺癌细胞的研究进展

外周血循环中癌细胞的检测是判断肺癌患者复发，转移和疗效的有价值指标，应用RT－PCR技术检测外周血中肺癌细胞是近年发展起来的新方法，本文综述了近年来有关这方面的报道。     

荧光探针定量PCR检测HBV—DNA

本文采用荧光探针定量（ＦＱ－ＰＯＣＲ）法准确定量检测ＨＢＶ－Ｍ阳性标志中的ＨＢＶ－ＤＮＡ数量。结果显示：ＨＢｅＡｇ（＋组（３２份）的阳性率为１００％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数范围在１０＾５－１０＾９／ｍｌ之间。ＨＢｅＡｂ（＋）组（４７份）的阳性率为２３．４％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝范围在１０＾３－１０＾５．７／ｍｌ之间;ＨＢｓＡｂ（＋）组（３７份）的阳性率为２．７％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数为１０＾５／ｍｌ。     

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清,血浆,淋巴细胞、尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞,尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４６．３８％,８０．００％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－Ｐ     

胃肠道肿瘤患者外周血CEA-mRNA的荧光定量RT-PCR检测表达

目的 研究胃肠道恶性肿瘤患者外周血CEA-mRNA表达的临床意义。方法 采用用荧光定量RT-PCR检测外周血CEA-mRNA的表达。结果 胃肠道恶性肿瘤患者83例外周血CEA-mRNA的表达阳性率为56.6％,对照组27例(健康人)未见表达。原发性肿瘤、远端转移的患者外周血CEA-mRNA呈高表达,而化疗后外周血CEA-mRNA表达阳性率和水平下降(P<0.05)。结论 荧光定量RT-PCR检测胃肠道恶性肿瘤患者外周血CEA-mRNA的表达具有敏感性、特异性。因而,对胃肠道恶性肿瘤的辅助诊断、决定治疗手段、判断疗效、有否转移和预后有着重要的临床价值。     

逆转录-聚合酶链反应检测人外周血单个核细胞中γ干扰素的表达

探讨检测γ－干扰素（ＩＦＮγ）自然表达状况的方法。用多重逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法检测了１５例ＳＬＥ患者和１０名正常人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中ＩＦＮγmＲＮＡ表达的水平。以异硫氰酸胍－酚－氯仿。一步法提取总ＲＮＡ，逆转录后同管扩增β－actin与ＩＦＮγ，扩增产物电泳后经光密度扫描仪扫描。扩增后β－actin与ＩＦＮγ条带清晰可见。与正常人相比，活动期ＳＬＥ患者ＰＢＭＣ中ＩＦＮγmＲＮＡ表     

实时荧光定量RT—PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用

实时荧光定量RT—PCR技术是一种新近发展起来定量检测mRNA表达水平的灵敏方法。本介绍了目前应用的四种荧光定量RT—PCR反应系统：即水解探针、杂交探针、DNA—染料结合和分子灯标RT—PCR反应系统，并对实时荣光定量RT—PCR反应系统的实验设计原则及所需仪器进行了介绍。     

特定mRNA的定量检测

本文概述了常用的特定基因转录产物mRNA的定量检测方法，并比较了各自的特异性、灵敏度、主要优缺点和影响因素，尤其对新出现的基于RT－PCR的各种定量法作了分析比较。     

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌（DH5a）,经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落,提取质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）;通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL;拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应在前列腺特异性抗原基因检测中的应用价值

目的　利用Taqman技术 ,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应 (FQ RT PCR)技术 ,对前列腺癌病人外周血中前列腺特异性抗原基因 (PSAmRNA)进行定量检测。方法　在PSA基因的外显子 2和 3之间设计一对引物和一条Taqman探针 ;优化反应体系的条件 ,以不同LNCaP细胞含量为标准品和其循环阈值 (Ct值 )制作标准曲线 ,检测外周血中PSAmRNA含量 ;对本方法进行方法学评价及初步临床应用评价。结果　成功建立了FQ RT PCR检测PSAmRNA技术 ,本方法最低检测限为每毫升全血 5个LNCap细胞 ,线性范围为 5～ 1 0 8细胞 /ml,批内和批间变异系数分别为 9 5 %～1 4 3%和 1 5 2 %～ 2 0 1 % ,扩增产物克隆和测序分析显示本扩增片段为PSAmRNA序列的特异性片段。初步临床研究显示 ,1 0例经ECT ,检查证实骨转移的前列腺癌患者的外周血均检到PSAmRNA ,其含量变化为 8～ 1 0 4细胞 /ml,健康男性、女性各 5名外周血中PSAmRNA含量均小于本法最低检测限。结论　荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PSAmRNA具有灵敏、特异、简便、结果数据化等特点 ,该方法可为前列腺癌微转移诊断、预后判断、指导治疗等奠定良好基础 ,同时也为其他肿瘤患者外周血中肿瘤细胞检测提供了方法学启示     

荧光定量聚合酶链反应检测在肺结核诊断中的应用价值

目的分析荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TbDNA)在诊断肺结核中的应用价值。方法选择2018年1月-2020年1月湖南省儿童医院收治的21例肺结核患儿作为肺结核组,另外选择同时期21例排除肺结核感染的肺部疾病患儿作为非肺结核组。全部患儿均行痰涂片抗酸染色镜检、纤维支气管镜(纤支镜)痰涂片抗酸染色镜检和BALF中TbDNA荧光定量PCR检测。比较3种检测方法对肺结核诊断的特异度、敏感度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果痰涂片抗酸染色镜检、纤支镜痰涂片抗酸染色镜检和荧光定量PCR的敏感度分别为19.05%、14.29%、76.19%,特异度分别为100.00%、100.00%、95.24%,PPV分别为100.00%、100.00%、94.12%,NPV分别为55.26%、53.85%、80.00%。荧光定量PCR检测BALF中TbDNA的敏感度明显高于痰涂片抗酸染色镜检和纤支镜痰涂片抗酸染色镜检(76.19%比19.05%、14.29%),差异有统计学意义(P<0.05);3种检测方法的特异度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA,具有快速、敏感度高、特异度高的特点,利于早期诊断肺结核,尤其是对于痰涂片检测呈阴性及无典型影像学特征的患儿,可以明显提高确诊率,其结果能够作为诊断肺结核的主要指标。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌

目的为快速检测、鉴定鸭沙门菌，避免血清型误判，提高鸭沙门菌暴发应对能力，建立一种实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测方法。方法随机挑选60株鸭沙门菌及238株肠道常见病原菌代表菌株，针对鸭沙门菌血清型特异基因AW58_15605设计引物并建立qPCR检测体系，通过纯菌菌株、模拟粪便样本及临床样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果60株鸭沙门菌株及临床感染的50份样本扩增结果均为阳性，而对鸭沙门菌血清型以外的其他沙门菌及肠道菌的扩增均为阴性。 对鸭沙门菌纯菌DNA的最低检测下限为8拷贝/反应。 粪便模拟样本检测中，增菌后qPCR检测下限达59.10 cfu/g，明显低于分离培养及增菌前。结论本研究建立的基于特异基因的鸭沙门菌分子检测方法具有可操作性强、特异度高、灵敏度高的特点，建议在应急情况下优先选择qPCR用于沙门菌暴发筛查、鉴别及诊断由其引起的腹泻性疾病。     

实时荧光定量PCR检测DHX32 mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测DHX32 mRNA的方法并研究其在结直肠癌中的表达。方法用Taq-Man探针建立检测DHX32 mRNA的FQ-RT-PCR方法,评价其特异性、重复性及扩增效率,并用该法检测DHX32 mRNA在结直肠癌中的表达水平。结果批内变异系数1.1%～1.9%,批间变异系数1.2%～2.5%;扩增效率为0.85,相关系数为0.9990。癌组织DHX32 mRNA表达水平中位数为1.90×10-3(四分位间距5.47×10-3),明显高于癌旁组织0.09×10-3(四分位间距1.41×10-3),两者差异有统计学意义(P<0.05)。DHX32 mRNA表达水平与结直肠癌癌栓形成、淋巴结转移、组织学分级以及Dukes分期关系密切(P<0.05)。肿瘤的恶性程度越高,DHX32 mRNA表达水平越高。结论FQ-RT-PCR检测DHX32 mRNA的方法特异性好,重复性高,操作简单,无污染。DHX32 mRNA表达上调可能在结直肠癌发生、发展中起重要作用,其表达水平可作为结直肠癌恶性程度的评价指标。     

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素(FAM),检测GAPDH基因的探针标记六氯(HEX)荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同一PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应(the double chromatogra-phy fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC-FQ-PCR),分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐...     

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素（FAM）,检测GAPDH基因的探针标记六氯（HEX）荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同-PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应（the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC—FQ—PCR）,分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μLFQ—PCR反应体系中,加入最少约0．05ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐氏综合征患者的GAPDH与DSCRl的差值为0．65±0．17,以2^-△CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．77～1．39。而20例染色体检测为正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0．06±0．18,计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1．18～0．92;2组问的差异有统计学意义。在100例羊水细胞的检测中,以DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1．35为唐氏综合征的判定标准,发现2例为患儿,其余98例为正常,与染色体检查结果一致。结论双色荧光定量PCR检测唐氏综合征是一个可行的、快速的、准确的、高通量的、费用较为低廉的检测方法,该法在唐氏综合症的基因诊断和产前基因诊断具有广阔的应用前景。