实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

耐多药结核分枝杆菌双组份系统反应调节子表达的研究

目的 检测MTB耐多药菌株和敏感菌株的TCS反应调节子的表达水平,以筛选出与MTB耐药相关的TCS。方法将7H9肉汤培养至对数生长期的MTB进行总RNA的提取和纯度鉴定;然后进行反转录,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测MTB的TCS反应调节子表达水平,以筛查出在耐多药菌株和敏感株中差异表达的TCS反应调节子。检测1NH、SM和LFA压力下这些差异表达的TCS反应调节子的表达水平。结果 与敏感菌株相比,在耐多药菌株中Rv0491、Rv3133c、Rv3143和Rv3246c分别上调表达1.03、7.11、3.48和1.37倍,差异有统计学意义（t或t'=5.623、-4.196、-3.559、-3.016,P＜0.01）。而其余反应调节子的表达在耐多药菌株和敏感菌株之间差异均无统计学意义。在抗生素压力下,Rv1027c、Rv3246c和Rv3143的表达明显升高,Rv0491和Rv3133c则变化不明显。结论Rv3246c和Rv3143的差异表达可能是MTB耐药的重要机制之一,可为新型抗结核药物的研制提供理论依据。     

2318株结核分枝杆菌耐多药性分析

目的 探讨贵阳市肺科医院住院结核病患者中的耐药情况,为临床诊断和治疗耐多药结核病提供可靠的科学依据.方法 对2004年1月至2009年8月住院患者的临床分离株进行菌型鉴定后,进行药物敏感性试验,分析不同类型结核病患者的耐药情况.结果 2318株结核分枝杆菌耐多药率为23.8%,初始耐多药率为12.1%,获得性耐多药率为63.8%.结论 目前结核病患者耐药率较高,应尽快加强耐药结核病患者的防治工作,减少和避免耐多药结核病患者的产生.     

应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.     

探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区(- 17～-8位点)、ahpC启动子区(-44～-30以及-15 ～3位点)及inhA94位密码子的熔解温度(Tm值)差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％( 162/833),在所检出的14种INH耐药突变katGS315T( AGC →ACC)、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N (AGC→AAC)这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％(135/162).结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.     

结核分枝杆菌耐多药的基因研究

目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结分村以杆菌临床分离析耐利福平（rpoB)、链霉素（rpsL)和异烟肼（KatG）基因检测。结果 38株 敏感株中,各有1株（206%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;90株耐多药析中,分别有81株（90.0%)、71株（78.9%)和63株（70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;有77株（85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变;10株耐其他药物株中,仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变,且耐药基因突变率与耐药浓度有关。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变的研究

目的 了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇（EMB）分离株embB基因突变情况,研究其应用价值。方法 通过聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP)、CPR－限制性片段长度多态性（RFLP）和PCR－直接测序技术分析102株结核分枝杆菌临床分离株embB基因。结果 以H37Rv标准株为对照,102株结核分枝杆菌临床分离株的162rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。41株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常,RFLP和测序分析与对照株相同。61株耐EMB分离株可,23株（37．7％）embB基因SSCP泳动异常;8株RFLP分析异常;测序分析23株均为306位密码子突变,其EMB MICs均≥20μg/ml,其中8株为ATG→ATA或ATT突变,13株为ATG→GTG或CTG突变,后者EMB MICs均≥30μg/ml。结论 部分结核分枝杆菌耐EMB是由于其embB基因突变所致,PCR－SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌EMB耐药基因型,简便、快速的方法。     

应用等位基因多重聚合酶链反应检测结核分枝杆菌katG基因315位点突变

目的 建立等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）方法，检测katG基因315位点的突变。方法 根据结核分枝杆菌的katG序列，分别设计出3条特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，检测katG基因315位点的突变以间接判断对异烟肼的耐药性。同时与常用的RFLP方法进行比较。结果 对临床分离异烟肼敏感株（30株）及异烟肼耐药株（54株）分别采用MAS-PCR和PCR．RFLP方法同时进行扩增，敏感株均未见有突变。MAS-PCR对耐药株的检出率为88．9％（48／54）。对于RFLP方法无法检出的S315N类型的突变亦能检出。结论 MAS-PCR方法有较高的敏感性及特异性，快速、经济、操作简便。     

耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究

目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性. 方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,2检验分析二者之间的相关性. 结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2%)对EMB耐药,41株(48.8%)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9%)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0%),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5%),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(2=25.58,P=0.00).embB306是最常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(2=12.37,P=0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0%和65.1%,58.5%和73.2%,76.2%和69.0%. 结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.     

结核分支杆菌耐喹诺酮等四种耐药基因检测的临床应用和评价

目的：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR—SSCP)检测结核分支杆菌耐药基因(rPOB、katG、rPSL和gyrA)，评估它的临床应用价值。方法：通过Bactec-960快速培养，利用PCR-SSCP和药物敏感试验了解96例肺结核病人结核分支杆菌耐药情况，分析临床治疗效果。结果：利福平、异烟肼、链霉素和喹诺酮类耐药率分别为59．4％、52．1％、62．5％和51．0％。分离株rPOB、katG、rPSL和gyrA基因突变率分别为57．3％、45，8％、58，3％和47．9％，药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。结论：结核分支杆菌耐药与基因突变有关，耐药基因检测指导治疗是一种新探索，与药敏试验联合应用可互相弥补，可成为临床指导用药的好方法。     

中国结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及其耐药性分析

目的 选用间隔区寡核苷酸分型方法对有中国代表性的菌株进行基因分型,研究不同基因型在中国的流行情况,并分析基因型与耐药表型的关系.方法 中国疾病预防控制中心于2007-2008年,按照流行病学抽样的原则从中国31个省收集涂片阳性的结核病患者的临床分离株4 017株,采用比例法进行药物敏感性实验,选用寡核苷酸分型方法对菌株进行基因分型.基因型检出率差异比较采用x2检验.结果 在4017株结核分枝杆菌临床分离株中,北京基因型菌株包括2 500株(62.2％).北方地区来源菌株北京基因型检出率达76.5％(1 913株),高于南方地区检出率(53.2％,1 330株),差异有统计学意义(x2=219.69,P＜0.05).南方地区T1型检出率达13.3％(332株),高于北方地区检出率(4.3％,108株),差异有统计学意义(x2=88.07,P＜0.05).北京基因型在耐利福平(21.7％)、耐氧氟沙星(4.9％)和MDR( 11.3％)的比例都高于非北京基因型的相应菌株比例18.4％、2.4％和7.4％,差异有统计学意义(x2值分别为22.10、14.42和14.83,P均＜0.05).结论 北京基因型目前仍然是中国主要流行基因型,并且比例呈现出地域差别,北方地区显著高于南方地区.北京基因型菌株与耐利福平、耐氧氟沙星和MDR有关.