酵母双杂交系统中LRP16诱饵质粒的构建

目的:在酵母细胞中构建LRP16诱饵质粒,以期从人cDNA文库中钓取可与LRP16相互作用的蛋白。方法:pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收,获得LRP16的基因片段,将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切验证其正确插入方向后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187,并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性。随后提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果:重组诱饵质粒经酶切验证,片段大小和插入方向均正确,将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性,Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRP16蛋白。结论:构建的重组质粒pGBKT7-LRP16能够在酵母细胞中正确表达,可作为酵母双杂交系统的诱饵质粒。     

利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的 构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性.方法 提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA, PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ, 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用.结果 构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用.结论 证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制.     

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

神经退行性疾病潜在致病肺炎衣原体蛋白Cpn0147酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：构建Cpn0147酵母双杂交诱饵载体,为应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的蛋白奠定基础。方法： 应用PCR扩增技术获得Cpn0147基因片段,克隆入pGBKT7载体,鉴定构建是否成功,确定构建成功后将重组载体pGBKT7-Cpn0147转入AH109及Y187酵母中,进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析。结果：Cpn0147诱饵载体构建成功,且该诱饵载体无自激活活性,对两种宿主酵母细胞无毒性。结论：诱饵载体pGBKT7-Cpn0147可用于酵母双杂交系统,为进一步筛选与之相互作用蛋白提供了实验基础。     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的构建日本脑炎病毒核心蛋白（JEV C蛋白）基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均〉0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML-V的构建、表达及鉴定

目的:构建早幼粒细胞白血病基因变异蛋白(Promyelocytie leukemia,PML-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)筛选与PML-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法:PCR扩增PML-V,克隆人诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PML-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果:成功扩增了PML-V基因片断,并克隆人pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论:成功构建了PML-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的 构建日本脑炎病毒核心蛋白(JEV C蛋白)基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应.方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoR1/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PE G/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化人酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达.结果 重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均＞0.8,在SD/-TrpPMA培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC.结论 成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pCBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pCBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础.     

COX-2诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的构建环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)筛选与COX-2相互作用的蛋白建立实验基础。方法 PCR扩增COX-2基因编码区全长,引入酶切位点EcoRⅠ、BamHⅠ,将COX-2基因克隆至载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pGBKT7-COX-2转化到酵母细胞Y190中,检测pGBKT7-COX-2在Mathmaker GAL4Two-Hybrid System3中有无自激活作用。结果 成功扩增了COX-2基因编码区全长,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确,并成功转化到酵母细胞Y190中,检测无自激活作用。结论 成功构建了COX-2的酵母诱饵载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

DNA修复蛋白Ku70酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

目的构建Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,为研究Ku70及其相互作用蛋白在乳腺癌中的作用机制奠定基础。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法从人宫颈癌HeLa细胞株扩增出Ku70cDNA全长片段,用SalI和EcoRI双酶切Ku70cDNA片段后定向克隆到真核细胞表达载体pGBKT7,获得诱饵质粒pGBKT7-Ku70,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后转化到酵母菌株AHl09,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-KuT0的自激活作用,同时利用蛋白质免疫印迹检测诱饵蛋白Ku70的表达。结果Ku70cDNA正确克隆到载体pGBKT,转化到酵母菌株AHl09中的诱饵载体pGBKT7-KuT0经表型筛选证实无自激活作用,蛋白质免疫印迹检测显示pGBKT7-KuT0在酵母细胞中稳定表达诱饵蛋白Ku70。结论成功构建了Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,并且在酵母菌株AHl09中稳定表达。     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A/Guangdong/7028/2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性;酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5.22%,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾/钠ATP酶β1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体γ亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

HLH缺失型Id2在酵母双杂交系统中的表达及自激活检测

目的:构建HLH结构域缺失的DNA结合抑制因子(Id2)诱饵质粒,并检测其在AH109酵母中的表达及表达产物对酵母的有无毒性作用和对报告基因的有无转激活作用。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒,将构建成功的诱饵质粒转化AH109感受态酵母菌中,检测其是否具有自激活作用及对酵母的毒性作用,用Western blot方法检测其在酵母中表达的融合蛋白。结果:成功构建Id2的HLH缺失体,Id2的HLH缺失体在酵母中能够正确表达,对AH109酵母无毒性作用,对报告基因无自激活作用。结论:HLH结构域缺失型Id2蛋白适用于采用酵母双杂交系统筛选其相互作用蛋白。