口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆与原核表达

以亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)为研究对象,通过逆转录并进行PCR扩增得到非结构蛋白3ABC基因,然后定向克隆到原核表达载体PET-32a,重组质粒PET-3abc转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE检测,证明重组蛋白PET-32a-3ABC成功在大肠杆菌中表达。以表达产物作为抗原,为鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。     

孕晚期产前抗生素治疗无乳链球菌感染对新生儿的影响

 目的 探讨孕晚期产前抗生素治疗无乳链球菌(group B streptococcus,GBS)感染对新生儿的影响,以及早期发现新生儿败血症的检测指标。方法 收集解放军总医院第五医学中心2017-01至2019-12入住新生儿科病房的GBS筛查阳性孕妇所生的高危新生儿105例,根据孕母产前是否抗生素治疗分为抗生素组及对照组。其中抗生素组45例,对照组60例。两组新生儿于生后6、24、72 h采集静脉血2 ml,检测血常规及C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP),生后72 h检测降钙素原(procaicitonin,PCT);入院后两组患儿首次检测白细胞或CRP异常,予青霉素治疗,同时在青霉素治疗前完善血培养检查,并比较两组败血症发生率。结果 抗生素组与对照组患儿生后6、24、72 h白细胞数之间的比较无统计学差异,对照组患儿生后24、72 h所测CRP均高于抗生素组(P＜0.05)。抗生素组、对照组患儿生后72 h所测PCT比较无统计学差异。对照组发生新生儿GBS败血症(血培养为GBS)2例,临床诊断败血症7例;抗生素组发生GBS败血症(血培养为GBS)1例。对照组败血症发生率明显高于抗生素组[2.2% vs. 15.0%,χ²=4.872,P=0.027]。结论 GBS筛查阳性的孕妇如产前未经过抗生素治疗,其所生新生儿发生败血症的概率明显增高;在GBS筛查阳性的孕妇所生的高危新生儿中,CRP可作为早期发现败血症的检测指标。     

HCMV gp52基因的克隆与表达

目的：克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)gp52基因，制备特异性抗原，用于HCMV早期诊断。方法：从感染的HCMV细胞上清液中提取病毒的DNA，用PCR扩增gp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段，并将其克隆到pGEM-Teasy载体测序，然后将其克隆到含有谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5x-3中表达，表达产物经GST亲和层析柱纯化后，采用ELIA和免疫印迹(Westem blotting)检测重组蛋白的抗原性。结果：经序列测定gp52基因片段的序列正确，并在pGDX-5x-3表达载体中得到了高效表达。表达的融合蛋白用亲和层析柱纯化后经免疫印迹和ELISA分析具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清呈特异性反应。结论：通过基因工程制备的重组gp52蛋白可作为抗原用于HCMV感染者的早期诊断。     

铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆与原核表达

为建立铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(Exotoxin A,ETA)的原核表达方法,采用PCR技术扩eta基因,将其插入pET-28a载体构建重组质粒pET-28a-eta,并对重组质粒进行双酶切、PCR及测序鉴定。转入BL21(DE3)中诱导表达,检测目的蛋白大小及反应原性,然后进行表达条件的优化及其表达形式检测。结果表明,所扩增eta基因大小为1917 bp,与GeneBank参比序列一致性在98.70%;蛋白分析表明,rETA大小为74 KDa,具有和天然毒素相似的反应原性。目的基因在37℃、0.6 mmol/LIPTG诱导3 h获得最佳表达。该蛋白在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主。该研究为进一步开展ETA的批量纯化提供了前提条件。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的：表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugomushi)Karp株56000表面蛋白，探索其作为诊断抗原的可能性。方法：采用PCR方法，从Ot．Karp株菌种基因组DNA中扩增出56000成熟蛋白基因片段，将该片段克隆于原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30／56，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果：(1)获得长约l500bp的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因；(2)SDS-PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为56000的独特蛋白带；(3)表达后菌体超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体形式存在；(4)重组表达质粒序列分析结果显示，pQE30／56中插入的基因片段的序列与已报道的Ot．Karp株56000外膜蛋白基因序列基本一致。结论：获得了Ot．Karp56000蛋白基因，并在大肠杆菌中实现了表达，表达的重组蛋白具有免疫反应性。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

丙型肝炎病毒ＮＳ３丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达邓小艺朱千政杨佩英军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１００８５０丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）是输血后非甲非乙肝炎的主要病原体，约有４０％～５０％的丙型肝炎病人可发展成为慢性...     

人骨形成蛋白2的基因的克隆和序列分析

目的 克隆人骨形成蛋白2基因全长。方法 以成骨肉瘤细胞总RNA为模板，应用转录酶-多聚酶链反应法克隆人骨形成蛋白2的cDNA全长；将获得的基因插入pGEM—T—Easy载体质粒，并转化至大肠杆菌后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切分析鉴定重组质粒。结果 通过质粒酶切分析和序列测定，我们获得的基因为人骨形成蛋白2全长DNA序列。结论 克隆获得人骨形成蛋白2的基因，为其进一步开发利用提供了前提条件。     

绵羊Oct4基因的克隆及序列分析

为了克隆出绵羊的Oct4基因的编码区序列,研究利用RT-PCR技术,根据GenBank中小鼠、人,猪、牛等的Oct4基因编码区序列设计出特异性引物,从绵羊囊胚中扩增绵羊Oct4编码区序列并进行测序,分析。结果表明,绵羊Oct4基因的编码区长度为1083bp,其中包括终止密码子,可以编码360个氨基酸。绵羊Oct4基因CDS区的核苷酸序列与牛、猫、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和猪等物种相似,比较相应序列,同源性分别为97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2%和94.7%;比较其氨基酸序列,同源性分别为98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和97.2%;使用生物信息学软件分析结果表明,绵羊Oct4基因含有两个POU特异结构域和1个HOMEOBOX-1结构域。本研究为进一步探索Oct4基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程的过程中的作用奠定了基础。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

目的 :克隆人黑素瘤分化相关基因 (melanomadifferentiationassociatedgene ,mda 7/IL 2 4 ) ,并在大肠杆菌中表达。方法 :从PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞提取总RNA ,根据mda 7/IL 2 4基因序列设计引物 ,用PCR法扩增mda 7/IL 2 4基因。将mda 7/IL 2 4基因插入表达载体pET 2 8a(+)中 ,构建表达载体pET 2 8a mda 7/IL 2 4 ,用IPTG诱导目的蛋白在E .coli中表达。通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定。结果 :经RT PCR从人外周血分离的淋巴细胞中扩增到mda 7/IL 2 4cDNA ,序列分析与文献报道一致 ;SDS PAGE分析表明 ,经 0 .5mmol/LIPTG 37℃诱导 4h后在E .coli中有大量mda 7/IL 2 4融合蛋白表达 ,相对分子质量约为 2 8× 10 3 ,融合蛋白约占诱导菌总蛋白的30 % ;Western印迹分析提示 ,诱导表达产物能与His单抗发生特异性反应。结论 :从人外周血淋巴细胞中获得了mda 7/IL 2 4的全长cDNA ,融合蛋白在E .coli中获得高效表达。     

人载脂蛋白A～Ⅰ的基因克隆﹑原核表达及多克隆抗体的制备

目的获取人载脂蛋白A～Ⅰ(ApoA～Ⅰ)的重组蛋白,并用于多克隆抗体的制备。方法从人肝细胞(LO2)中提取总RNA后,经RT～PCR法得到人ApoA～Ⅰ基因片段,用以构建融合表达载体pGEX～6P～1～ApoA～Ⅰ的重组质粒;将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,用异丙基硫代～β～D～半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST～ApoA～Ⅰ包涵体蛋白,通过蛋白复性和纯化后免疫小鼠得到多克隆抗体,并用ELISA法检查其效价。结果经PCR扩增出的ApoA～Ⅰ基因片段(746bp)与理论值大小基本一致。SDS～PAGE(十二烷基磺酸钠～聚丙烯凝胶电泳)以及West-ern blotting(蛋白印迹分析)验证纯化后的蛋白质分子量与质谱分析数据相符。免疫小鼠所得的免疫血清通过ELISA显示其抗体效价也具有高度特异性。结论成功地在大肠埃希菌中诱导表达出了ApoA～Ⅰ,蛋白质通过纯化免疫小鼠,得到了特异性的多克隆抗体。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

力竭运动后大鼠海马脑区谷氨酸受体NR2A蛋白含量和基因表达的变化

目的:观察力竭运动前后大鼠脑中海马谷氨酸受体NR2A蛋白含量和基因表达的变化,探讨其与运动性疲劳的可能联系。方法:50只SD雄性大鼠,随机分为安静对照组(S,n=10),力竭运动后即刻组(AE1,n=10),力竭运动后恢复0.5小时组(AE2,n=10),力竭运动后恢复3小时组(AE3,n=10)和力竭运动后恢复24小时组(AE4,n=10)。分别采用免疫印迹法和RT-PCR法测定一次性力竭运动后大鼠脑中海马谷氨酸受体NR2A蛋白含量和基因表达。结果:与安静对照组相比,力竭运动后即刻,大鼠NR2A蛋白含量明显升高,而mRNA表达显著减少;恢复0.5小时后,蛋白含量略有下降,mRNA表达显著增加;恢复3小时后蛋白含量显著下降,mRNA表达继续增加;恢复24小时后蛋白含量恢复到安静时水平,mRNA表达则减少至恢复0.5小时后水平。结论:力竭运动后即刻及恢复过程中,大鼠脑中海马谷氨酸受体NR2A蛋白含量及mRNA表达变化趋势不同,提示基因表达对蛋白含量的调控可能具有延迟性。